几丁质酶(EC3.2.1.14)是一种能水解几丁质中由β-1,4糖苷键连接的N-乙酰氨基葡萄糖胺(GlcNAc)的水解酶。几丁质是昆虫外骨骼、甲壳类动物的外壳以及真菌细胞壁的重要的结构组成部分。几丁质酶在营养、形态发生以及对病原菌侵染的抵御方面有着重要的生理学作用。斑马鱼是研究发育生物学的理想模式生物，而且其在免疫学、人类疾病以及癌症研究方面也有突出的贡献。目前在斑马鱼中已经发现有6种能编码几丁质酶/几丁质酶类似蛋白的基因，而且其在胚胎发育的10个不同阶段的表达模式也已经有相关报道。然而，有关几丁质酶在斑马鱼中所起到的生理功能还不清楚。因此，本文的研究目的是功能性的阐述斑马鱼几丁质酶基因，探索其在斑马鱼胚胎、幼体发育阶段的功能。本文的研究将对斑马鱼胚胎如何保护自己不受病原菌侵染的作用机制的阐述打下基础。在本研究中，我们克隆了斑马鱼酸性几丁质酶-3的基因全长，并对其进行了分析。从斑马鱼酸性几丁质酶-3的氨基酸序列以及结构域来分析，它属于典型的18家族几丁质酶，包含有氨基端催化结构域、PGST铰链区以及羧基端的几丁质结合结构域。Chi3基因组结构的分析表明，与人类以及其他脊椎动物几丁质酶基因相类似，斑马鱼几丁质酶-3基因由12个外显子和11个内含子组成，这些研究表明在贯穿脊索动物进化的过程中，几丁质酶不论是在基因组组成上还是序列的同源性方面都是高度保守的。进化树分析表明，Chi3处于酸性几丁质酶分支，处于有颌类脊椎动物的基部。qRT-PCR显示Chi3在斑马鱼肝和肠的表达量非常高，这可能与斑马鱼的食性有关。斑马鱼是杂食性动物，摄食多种底栖动物和浮游甲壳类动物、蠕虫以及昆虫幼虫。分解食物中的几丁质可能会造成酶的高表达量。从qRT-PCR的结果还能看出，Chi3在胚胎中的表达量一直很低，直到受精后的第三天表达量才开始显著升高。之前的一些研究表明，几丁质酶可能在非特异性免疫应答中起到抵御微生物致病体的作用。而在本研究中，我们显示了重组蛋白rChi3可以水解人造几丁质底物4-methylumbelliferyl-β-D-N,N′,N″-triacetylchitotrioside，可以结合真菌白色念珠菌，也能对白色念珠菌的生长起到抑制作用。有趣的是，催化结构域重组蛋白Chi3-CD的酶活性、抑制真菌能力和结合真菌活性等都小于完整的Chi3蛋白，这证明几丁质结合结构域在斑马鱼几丁质酶3的免疫活性方面起着重要的作用。此外，我们还清楚阐释了斑马鱼胚胎中的Chi3也有抗菌活性。首先，斑马鱼卵提取液与抗-rChi3抗体孵育之后，其抗菌活性明显减弱；其次，将抗-rChi3抗体与白色念珠菌一同注射进胚胎之后，胚胎的累积死亡率明显升高，但是将纯化好的重组蛋白与上述物质一同注射进胚胎之后，其死亡率则有所下降；第三，Chi3也是杀死真菌的效应分子；当向胚胎显微注射抗-rChi3抗体之后，其裂解真菌的能力则有所降低。综上所述，这些都表明，斑马鱼几丁质酶-3不仅在食物消化方面起到作用，还有抑制真菌的作用，而且在早期胚胎的免疫中也起到了一定作用。