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牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,BVDV)主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD),该病尚无完全有效的防制措施,对养牛业造成巨大的损失。骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的重链抗体,仅由其可变区组成的抗体称为单域抗体,又称为纳米抗体。纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、强组织穿透性、高效表达等优点。构建抗BVDV纳米抗体基因文库,利用噬菌体展示技术获得高表达、特异性强的纳米抗体,为防治BVDV奠定基础。本文的主要研究内容如下:1、BVDV纳米抗体基因文库的库容量和多样性鉴定。本实验采用稀释计算法测定已构建的文库库容量,随机挑取24个单菌落进行菌液PCR对抗体文库的重组率鉴定,阳性单克隆测序;利用MEGA 4.0构建系统进化树、DNAMAN分析氨基酸序列同源性,评价基因文库的多样性。结果表明基因文库库容达到1.22×106、重组率约83.3%、氨基酸序列同源性为63.51%,说明文库在保存过程中其库容量没有受到环境的影响,多样性丰富。2、BVDV纳米抗体文库的筛选和克隆鉴定。利用M13K07辅助噬菌体对基因文库拯救得到噬菌体展示文库,测定其滴度。以BVDV全病毒作为目标抗原,将其结合于固相上,加入噬菌体展示文库,经三轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选后,随机挑取单克隆进行ELISA检测。结果拯救的噬菌体展示文库滴度约1.2×1013 cfu/mL,三轮筛选使噬菌体文库中的特异性单克隆得到有效的富集,ELISA检测得到1株阳性克隆,命名为VHH-A6。3、BVDV纳米抗体的原核表达和功能验证。根据VHH-A6基因的测序序列,设计引物,采用PCR扩增技术克隆VHH-A6基因,构建pET-28a(+)-VHH-A6重组原核表达载体,经SDS-PAGE检测目的蛋白,Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白,在细胞水平验证VHH-A6纳米抗体对BVDV复制的影响。结果表明:成功获得VHH-A6基因及其重组原核表达载体,得到高纯度的目的蛋白。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)测定MDBK细胞内的病毒拷贝数,结果发现100μg/mL的VHH-A6纳米抗体对BVDV的复制有一定阻断效果。本研究通过对BVDV纳米抗体文库进行三轮亲和筛选,从中筛选获得与BVDV特异性结合的纳米抗体VHH-A6片段,对其进行原核表达并纯化,细胞水平验证VHH-A6对BVDV的复制有一定的阻断效果,为进一步探讨纳米抗体干扰病毒复制机理奠定基础。