玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEA)是一种由镰刀菌属产生的,具有雌激素效应的真菌毒素,广泛地存在食品、饲料及其原料中。人和动物摄入过多ZEA会引发雌激素过多症,造成生殖系统功能紊乱。猪是对ZEA最为敏感的动物。在畜牧养殖过程中,ZEA污染的饲料会影响动物的健康,给养殖业带来了巨大的经济损失。与传统的去除ZEA的方法相比,微生物降解ZEA具有特异性强、效率高,对饲料和环境无污染等优点。因此研究微生物降解ZEA脱毒技术是非常必要的。本研究以一株从土壤中分离获得的、具有ZEA降解能力的地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)CK1为研究对象。研究菌株CK1体外发酵降解饲料中ZEA的能力以及经CK1菌降解后的ZEA污染饲料对仔猪的影响。从该菌株中克隆出ZEA降解酶基因,并使其异源表达,初步探究菌株CK1降解ZEA的分子机制,为饲料中酶制剂的应用提供理论基础。主要的试验内容及结果如下:试验一研究菌株CK1降解饲料中ZEA的能力。革兰氏染色显示菌株CK1属于革兰氏阳性菌。16S rRNA测序和系统进化树结果表明CK1菌株为地衣芽胞杆菌。菌株CK1在血平板上没有形成溶血环,且其基因组中未检测到溶血素和肠毒素基因,因此CK1是安全的,可以用来发酵饲料。将ZEA标准品与基础日粮混匀,用菌株CK1体外发酵降解ZEA污染日粮,通过高效液相色谱技术检测饲料中ZEA的含量。结果表明,菌株CK1能够较好的降解饲料中的ZEA,其降解率为61.06%。试验二研究CK1菌能否缓解饲料中ZEA对藏猪的毒害。试验选取18头体重为6.48±0.74 kg的刚断奶雌性藏猪仔猪,随机分3组,每组6个重复,试验周期为21天。对照组(C)饲喂基础日粮(不含ZEA),处理组1(T1)饲喂ZEA污染日粮,处理组2(T2)饲喂CK1菌处理后的ZEA污染日粮。结果显示,仔猪的生产性能在3个组中差异不显著。T1组仔猪阴户面积和生殖器官相对重量均显著高于对照组,而T2组则显著低于T1组。T1组仔猪血清中促黄体激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、孕酮(P)和雌二醇(E2)水平均显著低于对照组;T2组仔猪血清中LH、P和E2的含量显著高于T1组;血清中睾酮(T)的水平在3个组中均无显著差异。组织病理学检测显示,T1组卵母细胞形态异常,子宫外模脱落,肝脏组织中出现炎性细胞浸润现象,而T2组中这些症状明显减轻且组织形态接近对照组。T1组中,子宫、卵巢ERα的表达量和阴道ERβ的表达量均显著高于T2组和对照组,而这些指标在T2组和对照组之间并无显著差异。在阴道中,T1组中ABCB1和ABCb4表达水平显著高于T2组和对照组,ABCG2的表达水平与T2组无显著差异,ABCA1和ABCD3的表达水平在3个组中没有显著差异。在子宫中,T1组中ABCA1和ABCb4表达水平显著高于T2组和对照组,而ABCB1、ABCD3和ABCG2的表达水平在3个组中没有显著差异。在卵巢中,T1组中ABCB1、ABCb4、ABCD3和ABCG2的表达水平显著高于T2组和对照组,而ABCB1的表达水平在3个组中无显著差异。在阴道、子宫和卵巢中,ABC转运载体的表达水平在T2组和对照组中均无显著差异(除阴道ABCG2)。结果表明,CK1菌能够缓解饲料中ZEA对仔猪的危害。试验三初步探究CK1菌株降解ZEA的机理。通过对已知ZEA降解酶进行生物信息学分析,成功从菌株CK1基因组上扩增到参与ZEA降解的基因prx31,片段大小为564 bp,编码187个氨基酸。NCBI BLAST分析发现,B.licheniformis CK1中的过氧化物酶PRX31属于典型的两个半胱氨酸硫氧还蛋白过氧化物酶(2-Cys Prx)。三维结构显示PRX31是环状络合物。将该基因与表达载体pET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3),构建了PRX31表达工程菌株,实现了该重组酶的异源表达。用镍柱亲和层析的方法获得纯度较高的蛋白,其浓度为1.45 mg/mL。该重组过氧化物酶PRX31能成功降解ZEA,其降解率为68.99%。该重组过氧化物酶PRX31降解ZEA的最适温度是40℃,最适时间是12 h,最适pH是8.0。此外,ZEA的降解产物可以显著地降低MCF-7细胞的增殖率。结果表明,在CK1菌中,PRX31至少是负责降解ZEA的部分原因。综上所述,菌株CK1能有效的降解饲料中的ZEA,保护仔猪免受ZEA的毒害,从根本上消除ZEA在食物链中的传播,保证畜产品安全,并为微生物法降解饲料中毒素提供了试验基础和理论依据。此外,初步探讨了菌株CK1降解ZEA的机制,为生物酶制剂的研制和开发提供了新的思路和方法。