茶树内生草螺菌WT00C(Herbaspirillum sp.WT00C)是本实验室从景观茶树中分离得到的一种具有促生作用和硒代谢功能的革兰氏阴性细菌。实验室已对该茶树内生草螺菌的生理生化特性、微生物学性质、分类地位、基因组学以及感染定殖等方面进行了深入的研究。前期研究发现,茶树内生草螺菌WT00C能在高浓度硒酸盐(50-500 m M)中生长并能有效地将硒酸盐还原成元素硒(Se~0),但是其机理尚不清楚。为了探究高浓度硒酸盐对茶树内生草螺菌WT00C的生长和硒化合物代谢的影响,本课题利用了微生物学、蛋白组学、半定量RT-PCR等方法对其进行了研究。经过研究,取得如下成果:1.茶树内生草螺菌WT00C在含有200 m M硒酸钠的LB培养基中培养结果显示:该菌在经过一个12小时的生长抑制期后开始恢复生长并在培养30小时后达到稳定期。将在200 m M硒酸钠的LB培养基中培养28小时的茶树内生草螺菌细胞再次接入含有200 m M硒酸盐的培养基中培养,其生长抑制期缩短至6小时;而将相同的细胞接种至不含硒酸盐的培养基中培养,生长曲线与原始细菌相同。2.利用扫描电镜对细菌形态进行观察后发现,在含有200m M硒酸钠的LB培养基中培养的茶树内生草螺菌WT00C细胞逐渐变成粗棒状,其直径变为原始细菌的2倍。将这种粗棒状的茶树内生草螺菌WT00C转接至普通LB培养基中培养多代(4个24小时重复)后,扫描电镜观测显示其形态与原始细菌相比无明显差异。由此可知,高浓度硒酸盐不仅会影响茶树内生草螺菌WT00C的生理代谢过程而且会影响细菌细胞的形态结构,但这种影响应该是一种生理反应而非遗传变异。3.通过分析不同培养时期培养基内硒酸盐和亚硒酸盐含量发现,在高浓度硒酸盐中培养茶树内生草螺菌WT00C的过程中,20小时内培养基中的硒酸盐和亚硒酸盐浓度并未显著降低至MIC值。这说明茶树内生草螺菌WT00C恢复生长不是由硒酸盐浓度显著降低造成,而是细菌自身建立起一套有效的抗氧化机制导致的。4.蛋白质组学分析发现:(1)在茶树内生草螺菌WT00C生长抑制期,高浓度硒酸盐会引起细胞内形成较高的氧化压力,高氧化压力使得细菌与DNA复制与修复、糖代谢、脂代谢等生命活动相关的蛋白表达量下调,最终导致细菌无法进行正常的生命活动,进而表现为一段较长的生长抑制期;(2)在高氧化压力的环境下,细菌细胞并未死亡,而是在12小时后恢复生长。造成这一现象的原因可能是茶树内生草螺菌WT00C通过增加NADPH等还原剂的量减缓了生长环境中的氧化压力。(3)在细菌生长恢复期,一些表达下调的蛋白逐渐恢复至正常水平(如DNA多聚酶III和RNA解旋酶),同时生产NADPH/NADH的酶、硫氧还蛋白还原酶(Trx R)以及谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)表达持续上调以保持细菌的抗氧化作用;(4)由于培养基中高浓度的硒酸钠仍造成较大的氧化压力,使得细菌细胞壁、细胞外膜和细胞离子通道结构不完整,从而引发细菌变形;(5)当粗棒状的细胞被转接至含有200 m M硒酸钠的培养基中培养后,其生长抑制期缩短至6小时,造成这一现象的原因可能是经过前一次高氧化压剌激后NADPH/NADH浓度增高,这使得细菌抗氧化作用更强。且由于脂质A-双糖合酶[EC:2.4.1.182]的持续上调使得细胞壁结构获得部分修复。5.半定量RT-PCR检测硒酸盐对与硒化合物代谢途经相关的39个基因转录的影响,结果显示与谷胱甘肽(GSH)代谢途经相关的5个基因中gs、gsr、gcs下调,gpx、gst上调,而两个与硒蛋白合成相关的基因sel A和trx B显著上调。这一结果提示随着硒酸盐浓度的提高,细菌细胞中谷胱甘肽的合成效率会降低,但硒蛋白合成的速度则会加快。6.茶树内生草螺菌WT00C在含不同浓度硒酸盐的培养基中培养后检测细菌蛋白的硒含量。结果显示在0—50 m M硒酸钠条件下,细菌蛋白中的硒含量呈非线性增加。这个结果不仅验证了茶树内生草螺菌WT00C的确能依据硒蛋白合成途径有效地合成硒蛋白而且证明了硒酸盐的确会增强细菌硒蛋白的合成。通过本课题的研究,发现高浓度硒酸盐不仅影响茶树内生草螺菌WT00C的生理生化代谢过程而且影响细菌形态结构。在由高浓度硒酸盐引起的高氧化压条件下,茶树内生草螺菌WT00C通过自身的抗氧化机制恢复生长,同时利用硒酸盐合成硒蛋白或将其还原形成元素硒(Se~0)。研究验证了茶树内生草螺菌WT00C硒蛋白合成途径的真实存在以及真实拥有合成硒蛋白的能力。这些实验结果为后续利用茶树内生草螺菌WT00C生产元素硒(Se~0)和硒蛋白、开发硒蛋白产品提供了理论依据和技术支持。