目的:(1)通过克隆 myogenin cDNA,构建 myogenin 克隆载体,构建 myogenin真核表达载体,为下一步肌细胞生成素转基因防治骨骼肌失神经萎缩的细胞实验和动物实验提供物质基础。(2)应用 myogenin 真核表达载体对原代培养的失神经骨骼肌内的成纤维细胞进行瞬时转染和稳定转染,检测瞬时转染中真核表达载体能否正确表达 myogenin,观察并鉴定 myogenin 的体外转染能否使来源于失神经骨骼肌的原代培养成纤维细胞转化成为成肌细胞,为后继的动物实验提供间接证据。(3)通过 myogenin 真核表达载体直接注射失神经骨骼肌这一方法,维持骨骼肌内 myogenin 的相对较高的表达水平,并通过分子生物学、形态学和生理学等检测方法来评价该基因转移方法对骨骼肌失神经萎缩的防治是否具有作用,为失神经骨骼肌萎缩的防治寻找新的思路,提供实验依据。方法:(1)通过 RT-PCR 的方法克隆 myogenin 全长 cDNA,将 myogenin cDNA连接到克隆载体 pGEM-T,形成重组 pGEMT-myogenin 克隆载体,利用大肠杆菌扩增克隆载体,提取、纯化克隆载体,Hind III 和 Xho I 双酶切克隆载体获得myogenin cDNA,将后者插入到 pcDNA3 载体中,形成重组 pcDNA3-myogenin真核表达载体,对其进行琼脂糖凝胶电泳、PCR、酶切鉴定和测序,检验所构建载体的正确性。(2)差速贴壁法原代培养失神经骨骼肌内的成纤维细胞,并其对进行其免疫组化鉴定;利用转染试剂 SuperFect 为介导,将 pcDNA3-myogenin真核表达载体对原代培养的成纤维细胞进行瞬时转染,Western Blot 检测myogenin 的表达量,验证载体能否正确表达蛋白;对成纤维细胞进行稳定转染,利用 G418 筛选培养液进行筛选,得到阳性克隆后,对其是否发生转化进行免疫荧光鉴定;扩增培养转化细胞,观察、摄影细胞生长情况、描记生长曲线;以明确 myogenin 的体外转染能否使原代培养的失神经骨骼肌内的成纤维细胞转化为成肌细胞。(3)在坐骨神经切断后 4 周,将 pcDNA3-myogenin 真核表达载体直接注射到小腿三头肌的入肌点周围,同时吻合坐骨神经,于 8 周后处死动物,对三头肌进行肌湿重、肌纤维横截面积、单刺激收缩力和强直收缩力检测,比较正常组、、生理盐水组和失神经组之间的差别;另一组动物分为基因治疗组和pcDNA3 空质粒组,分别在基因转移第 0、2、4、8 周进行 RT-PCR 和 Western Blot检测 myogenin 在 mRNA 和蛋白水平的表达变化,描记表达趋势图,以证实基因转染使失神经骨骼肌内 myogenin 的表达维持在相对较高的表达水平。探讨myogenin 真核表达载体的骨骼肌直接注射这一方法对骨骼肌失神经萎缩的防治是否具有意义。结果:(1)琼脂糖凝胶电泳、PCR、Hind III 和 Xho I 酶切鉴定结果证实重组 1<WP=6>复旦大学博士学位论文(中文摘要)pGEMT-myogenin 克隆载体中所克隆的 myogenin cDNA 的长度正确,测序结果证实本研究所克隆的 myogenin cDNA 序列与 1989 年 Wright 所报道的序列一致。(2)琼脂糖凝胶电泳、PCR、Hind III 和 Xho I 酶切鉴定结果证实重组pcDNA3-myogenin 真核表达载体内 myogenin cDNA 的序列长度正确,测序结果证实本研究所克隆的 myogenin cDNA 序列与 1989 年 Wright 所报道的序列一致。(3)Vimentin 染色和 Desmin 染色结果证实差速贴壁法所培养的细胞,为成纤维细胞,本法所培养的细胞中没有出现 Desmin 染色阳性的成肌细胞。(4)在瞬时转染实验中,Western Blot 检测到所有 5 个时间点均有 myogenin 的表达,表达的峰值出现在转染后 60 小时。(5)稳定转染后 48 小时,用终浓度为 800μg/μlG418的筛选培养液对转染细胞进行筛选,3 周后出现单细胞克隆,其 Desmin 染色结果阳性,为成肌细胞;将转化后的成肌细胞进行扩增培养,其细胞生长曲线显示该成肌细胞具有正常的分裂增生能力;1 周后进行分化培养,结果显示,分化培养 24 小时后即可见到肌管出现,这些肌管可以相互融合形成成熟的肌管。(6)分别检测失神经 4、6、8、12 周(即基因转移后 0、2、4、8 周)基因治疗组和pcDNA3 空载体组 myogenin 在 mRNA 和蛋白水平的表达,结果发现基因治疗组myogenin 在治疗过程中保持了相对较高的表达水平,而 pcDNA3 空载体组myogenin 的表达则呈现出明显的下降趋势。(7)肌纤维截面积和肌湿重检测结果显示:基因治疗组与 pcDNA3 空载体组、生理盐水组、失神经组有显著差别,基因治疗组与正常组有显著差别。(8)单刺激肌肉收缩力检测结果显示:基因治疗组与正常组无差别,而基因治疗组与 pcDNA3 空载体组、生理盐水组、失神经组有显著差别。(9)强直收缩力检测结果显示:基因治疗组与正常组比较有差别;基因治疗组与 pcDNA3 空载体组、生理盐水组、失神经组均有显著差别。结论:(1)克隆了肌细胞生成素(myogenin)cDNA。(2)构建了重组 pGEMT--myogenin 克隆载体。(3)构建了重组 pcDNA3-myogenin 真核表达载体。(4)差速贴壁法能够从失神经骨骼肌内获得纯度较高的原代成纤维细胞。(5)重组pcDNA3-myogenin 真核表达载体在 DNA 聚合物的介导下能够有效地转染到原代成纤维细胞内,并且能够表达具有?