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研究背景:登革病毒(dengue virus,DENV)是单股正链RNA病毒,属于黄病毒科、黄病毒属。DENV包含4个血清型:DENV-1,DENV-2,DENV-3和DENV-4。DENV的感染可引起一系列的临床症状,包括登革热(denguefever,DF)和登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)/登革休克综合征(dengue shock syndrome,DSS)。以蚊媒为主要传播媒介的DENV广泛流行于热带和亚热带地区。近20年来,随着全球气候变暖和全球化带来的人口流动性增加,DENV的暴发和流行更为频繁。中国的台湾、海南、福建、广东、广西和浙江等沿海省份均为DENV的流行地区。广州近几年的登革疫情呈高发态势。目前,世界上尚无可有效预防登革热的疫苗和相应的治疗药物。利用酿酒酵母表达系统生产的HBsAg和HPV颗粒疫苗的成功上市提示开发安全高效的DENV的病毒样颗粒(Virus-like particles.VLPs)疫苗具有广阔的应用前景。以DENV为代表的黄病毒VLPs是指通过在体外表达系统表达prM和E蛋白而组装成的,具有与病毒粒子类似的空间结构且不含病毒核酸的空心颗粒。由于VLPs保留了与天然病毒粒子类似的空间构型和诱导中和抗体的抗原表位,因此VLPs不但能诱导产生体液免疫,而且可以激发CD4+T细胞的增殖和CTL反应(cytotoxic T lymphocyte)。VLPs被认为是预防黄病毒感染的有效的、潜在的亚单位疫苗候选。
目的:利用含GAP(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)启动子的毕赤酵母组成性表达系统表达编码DENV-2 prM和E蛋白的融合基因,在成功获得DENV-2 VLPs的同时实现VLPs在该系统中的连续和高效表达。最后对VLPs的免疫原性和免疫保护性进行研究,为开发四价的DENV病毒样颗粒疫苗奠定基础。
方法:首先,通过分子遗传进化分析选择具有代表性的DENV-2流行株作为研发颗粒疫苗的候选株;利用RT-PCR的方法从病毒上清中扩增DENV-2的prM和E基因;设计并构建含全长的E蛋白的prME与含截去E蛋白TM2跨膜域的prME472,分析TM2的缺失对E蛋白分泌水平和VLPs组装的影响;利用在prM的N末端分别引入PrM信号肽和α信号肽以探索VLPs的高水平分泌表达。然后,将构建好的重组载体转化大肠杆菌,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,将重组载体转化毕赤酵母;将PCR鉴定正确的酵母克隆进行发酵表达;将发酵上清和细胞裂解液分别进行SDS-PAGE和Western blotting检测;并分析目的蛋白的连续性表达情况;利用发酵上清进行血凝实验检测VLPs的分泌情况;利用蔗糖梯度离心的方法从细胞裂解液中分离纯化细胞内的VLPs(Intracellular VLPs),利用超滤浓缩的方法纯化上清的VLPs(SecretedVLPs)。通过电子显微镜技术检测VLPs的结构以及在细胞内的组装特征。最后,将纯化到的VLPs免疫BALB/c小鼠,通过ELISA测定血清中特异性抗体的滴度;利用免疫荧光技术和体外中和试验检测VLPs的免疫反应性和中和抗体的滴度;对免疫鼠进行攻毒实验,评价VLPs能否诱导免疫记忆。
结果:
1.分子遗传进化分析结果表明,本实验室分离的DENV-2 ZS01/01株在进化树上与广东省2001株的DENV-2流行株,以及菲律宾1998-2001年的DENV-2流行株比邻,在基因分型上都属于全球流行(Cosmopolitan)基因型。因此,选取DENV-2 ZS01/01株作为DENV-2病毒颗粒疫苗的候选株具有广泛的代表性。
2.本研究成功构建了以下3种重组表达质粒,包括:含prM信号肽和全长E蛋白的pGAPA-SprME;含prM信号肽和截去E蛋白TM2端的pGAPA-SprME472;含α信号肽和全长E蛋白的pGAPαA-prME;并将重组质粒成功转化毕赤酵母X33,获得了重组表达克隆。
3.通过SDS-PAGE和Western blotting检测发现E蛋白分别在含prM信号肽和α信号肽的引导下分泌到上清中。prM信号肽的分泌效率高于α信号肽。同时,与全长的E蛋白相比,缺失TM2端的E蛋白的分泌水平并不没有得到明显的提高。研究结果还表明含GAP启动子的组成性表达系统能连续性和高效表达E蛋白。
4.在含prM信号肽重组子的表达上清中检测到了血凝活性。说明prM信号肽能有效的引导VLPs分泌到上清。且TM2端的缺失不会影响病毒颗粒的组装。
5.通过蔗糖密度梯度离心,分离到了大小分别为30 nm和55 nm的DENVVLPs。并通过透射电镜观察,发现这两种VLPs在酵母细胞内的组装特征与DENV病毒感染细胞中类似。
6.通过免疫电镜观察,在含prM信号肽的重组子的发酵上清浓缩液中检测到了30 nm的VLPs,说明VLPs可以被prM信号肽有效的引导分泌到上清中。
7.ELISA检测抗体滴度表明VLPs能诱导小鼠体内产生了高水平的的特异性抗体,最高滴度达到了1:10000。免疫荧光结果表明将VLPs免疫血清稀释1280倍后,仍在DENV-2感染的C6/36细胞浆内检测到了强烈的荧光信号。
8.体外中和试验表明,VLPs免疫血清能有效的中和DENV-2 NGC株对C6/36细胞的感染,中和滴度与灭活的DENV-2免疫血清相同,均为1:45。攻毒后VLPs免疫鼠的中和抗体滴度有了很大的提升,达到了1:100。免疫结果提示VLPs能诱导BALB/c鼠产生免疫记忆反应。
结论:
1.DENV-2 ZS01/01株属于全球流行基因型,可作为登革病毒样颗粒疫苗的候选株。
2.首次利用毕赤酵母非甲醇诱导表达系统成功的高水平表达了DENV-2VLPs。并在发酵上清中检测到了VLPs的分泌,为VLPs后续的应用奠定了基础。
3.首次在酵母表达系统中表达并分离到了两种大小分别为30 nm和55 nm的DENV-2 VLPs。并利用透射电镜技术发现DENV VLPs在酵母细胞中的组装特征与病毒感染细胞类似。研究结果提示组成型表达DENV VLPs酵母系统或许可以作为研究登革病毒组装和感染的理想模型。
4.通过免疫实验证实DENV-2 VLPs具有良好的免疫原性,免疫反应性和体外中和病毒的能力。免疫结果初步提示VLPs能诱导免疫鼠产生免疫记忆反应。