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糖尿病系一组由于胰岛素分泌缺陷及(或)其生物学作用障碍引起的以高血糖为特征的代谢性疾病。随着人口老龄化,糖尿病的发病率逐年上升。目前糖尿病已成为继肿瘤、心血管病之后危害人类健康的第三大疾病。糖尿病是一种复合病因的综合征,与遗传、自身免疫及环境因素有关。现代医学治疗糖尿病以西药为主,但这些药物会出现继发性失效且毒副作用较大,对糖尿病的并发症的防治上也存在不足。而中药以其毒副作用小、作用温和持久、具有综合治疗作用以及可延缓并发症等优点已经受到人们的重视。但中药量多且作用复杂,目前降糖中药主要以动物模型来筛选。该方法存在实验周期长且耗费大的缺点,为了寻找快捷有效的筛选降糖中药的方法我们进行了以下的实验研究:1、利用STZ制备糖尿病小鼠动物模型,观察中药R对糖尿病小鼠的治疗作用;2、建立大鼠原代肝细胞培养技术,利用高糖浓度制备肝细胞损伤模型,以建立筛选降糖中药的肝细胞模型; 3、降糖中药的筛选;4、探讨有效的降糖中药对细胞模型的治疗机理;实验结果如下。1.中药R对糖尿病小鼠的治疗作用1.1中药R能够明显降低糖尿病小鼠血糖糖尿病模型小鼠血糖增加,而R大剂量组在给药14天时糖尿病模型小鼠血糖明显降低;1.2中药R能够改善糖尿病模型小鼠的一般状况糖尿病模型小鼠的体重减低、饮食量和饮水量增加,而R组小鼠的体重增加、饮食量和饮水量有所降低,一般状况得到明显改善;1.3中药R能够改善糖尿病模型小鼠的病理损伤病理形态学观察显示,模型组小鼠胰岛萎缩、胰岛细胞数量减少,有淋巴细胞浸润,中药R组小鼠的胰岛数量明显增多,胰岛细胞大小基本正常,淋巴细胞浸润程度减轻,提示R能够改善模型小鼠的病理损伤;2大鼠原代肝细胞的分离及其形态学观察2.1肝细胞的分离方法采用两步灌流法分离SD大鼠肝细胞,在无菌状态下打开腹腔,经门静脉插管,先以流速为30ml/min灌流液开放灌注:10min后,改用37 oC、0.05%的胶原酶溶液(50ml)以相同速度进行循环灌流10min,剪碎肝脏后水浴摇床20min(200转/min,37 oC)台盼兰染色确定肝细胞的即时存活率。2.2肝细胞形态学观察新鲜分离的离体肝细胞前景干净,呈单个分散状态,圆形、透亮、具有立体感。培养2小时肝细胞开始贴壁。12小时后大约有90%以上的细胞贴壁生长,贴壁24小时后细胞形态发生改变,呈典型的上皮样多角形形态,胞体变平变薄,体积明显增大,细胞间出现索状或肝板状连接。胞核清晰可见双核或多核肝细胞。培养48小时后肝细胞肝细胞死亡较多,形态呈多角形形态,胞核清晰可见多核和双核肝细胞。3高糖损伤肝细胞模型的建立3.1模型制备方法采用高浓度葡萄糖(25mmol/L)刺激法,用含25mmol/L葡萄糖的培养基培养SD大鼠原代肝细胞,连续24小时。3.2细胞模型的病态表现3.2.1造模过程中我们动态观察了培养基中葡萄糖浓度的变化,结果发现模型组培养基中葡萄糖浓度的降低程度从造模12h开始明显低于正常组,说明高糖环境可以使肝细胞利用葡萄糖的能力降低。3.2.2造模过程中我们利用MTT法检测细胞OD值来反应肝细胞活性,结果发现模型组肝细胞活性从造模6h开始明显低于正常组。以上结果说明,本研究复制的筛选降糖中药的细胞模型中肝细胞利用葡萄糖的能力和肝细胞活性明显降低,利用此模型筛选降糖药物能够较好的反映药物对肝细胞利用葡萄糖能力的影响和药物对肝细胞的保护作用。4筛选有效的降糖中药通过大量的文献阅读,我们选取了六种已报道的具有降糖作用的六种中药组分:Rg、Rt、Dg、Dt、Tg、Tt,利用建立的筛选降糖中药的细胞模型,对其降糖效果和对肝细胞的保护作一评价。结果发现:Rg、Rt、Dg、Dt有明显的降低培养基中葡萄糖浓度的作用,对肝细胞也有一定的保护作用。Tg、Tt在这两方面的作用与模型组相比均没有差异。故本研究对Rg、Rt、Dg、Dt的降糖机理作进一步探讨。5 Rg、Rt、Dg、Dt的降糖机理研究本实验采用RT-PCR法研究Rg、Rt、Dg、Dt对肝脏糖代谢关键酶糖原合成酶和葡萄糖6磷酸酶mRNA表达量的影响。结果显示,模型组糖原合成酶mRNA表达降低,葡萄糖6磷酸酶的两种亚基葡萄糖6磷酸酶催化亚基(G-6-PC)和葡萄糖6磷酸葡萄糖转运亚基(G-6-PT)mRNA表达增高,与正常组相比统计学差异显著。Rg和Rt能明显增加肝细胞胞糖原合成酶mRNA表达,与模型组相比统计具有显著性差异,但对G-6-PC和G-6-PTmRNA表达没有影响; Dg和Dt能明显增高肝细胞胞糖原合成酶mRNA表达,能明显降低G-6-PC和G-6-PTmRNA表达,与模型组相比统计学差异显著。通过本研究,我们首先在动物模型上验证了中药R对糖尿病的治疗作用,然后利用高糖刺激肝细胞,首次建立了一种能够筛选降糖中药的高糖损伤细胞模型,此模型具有简单、经济、耗时短等优点;并且利用此模型验证了Rg、Rt、Dg、Dt的降糖效果;然后对这四种组分进行了初步的降糖机理研究,Rg、Rt、Dg、Dt通过影响肝脏糖代谢而实现降糖作用,这为临床用药提供了科学依据,也为后期开发新药打下基础。