论文部分内容阅读
水稻是世界性粮食作物之一,产量占世界粮食作物总产30%左右,我国占40%以上。水稻胚乳占糙米重量的90%以上,是人类食用的主要部分。胚乳的发育状况直接决定了稻米的产量和品质。有些基因仅在胚乳中表达,具有器官特异性。这些胚乳特异性基因包括印迹基因和非印迹基因。印迹基因的作用和调控与种子大小有关。对于非印迹基因的作用和调控方式需要研究。Assaf Zemac等对水稻胚乳的测序分析,发现存在165个特异表达基因。本研究根据Pubmed网站提供的籼稻和粳稻的SNP上的差异,以这165个特异表达的基因为基础,筛选并设计了22对非印迹基因的扩增引物。以籼稻9311和粳稻日本晴为亲本,以正反交后发育3天和5天的胚乳RNA为研究材料,采用测序方法,确定胚乳特异性的非印迹基因。并在叶片等其它部位进一步验证这些非印迹基因的表达特点。已知胚乳特异印迹基因表达的调控方式需要DNA甲基化参与,而非印迹基因的调控方式仍然未知。推测胚乳特异基因可能存在相同的调控方式,即DNA甲基化也参与调控非印迹基因的表达。为此,对籼稻和粳稻杂交后的种子,在萌发前期,用药品5-azacytidine (5-azaC)处理(浸泡),已知这些胚乳特异非印迹基因,在胚中是沉默的,去除DNA甲基化后,这些基因是否能重新在胚中表达?以处理后萌发的叶片及其对照的RNA为研究材料,分析非印迹基因的表达情况是否有改变。具体结果如下：(1)以杂交授粉5d的胚乳RNA为模板,筛选出4个胚乳特异性表达的基因。并证明了其胚乳特异性。针对文献中报道的165个基因,我们根据注释,侧重选择转录因子,初步筛选18个基因进行验证,根据籼稻和粳稻的SNP及引物的限制要求,共确定4个非印迹基因进行验证,作为本实验的目标基因。该结果显示这四个基因LOC_Os05g34310.1、LOC_Os07g08420、LOC_Os02g12310.1和LOC_Os01g24460.1仅在胚乳中表达,在叶片中沉默。(2)以杂交授粉3d和5d的胚乳RNA为模板做反转录PCR,结果表明LOC_Os05g34310.1、LOC_Os07g08420、LOC_Os02g12310.1这三个基因没有表现发育时间的差异,即不随着时间发生表达的变化。LOC_Os01g24460.1表现出时间特异性,即在发育3d的胚乳中,表现出对双峰中胸腺嘧啶的完全抑制,表现印迹基因的特征。在5d的胚乳中,则正常表达。(3)初步证实了DNA甲基化参与了水稻胚乳非印迹基因的调控。DNA甲基化可能对部分非印迹特异基因进行调控。用去甲基化试剂5-azaC处理日本晴与9311的杂交成熟种子之后,发现水稻发生矮化、发芽延迟的现象。反转录PCR实验表明只有LOC_Os07g08420和LOC_Os02g12310.1经5-azaC处理之后其在叶片中表达了,并且表现出对双峰中胸腺嘧啶的抑制。本研究发现5-azaC处理3d-9d的方案中,种子的萌发率普遍很低。选择处理NIP×9311、9311×NIP杂交种子,处理3d和5d后萌发植株的叶片RNA,检测了4个目标基因的表达变化,发现LOC_Os07g08420和LOC_Os02g12310.1基因的表达被激活,表明其在胚乳中的特异表达与DNA甲基化有关：而LOC_Os05g34310.1、LOC_Os01g24460.1在叶片中仍然保持沉默,说明其在胚中的沉默可能与DNA甲基化调控无关。(4)同一基因在不同材料中的多样性。部分基因的激活表达具有材料特异性。用5-azaC处理粳稻巴利拉与籼稻9311的杂交种子,处理3d。处理后在叶片中只有LOC_Os02g12310.1表现出双峰中胸腺嘧啶的抑制,LOC_Os07g08420无明显变化。LOC_Os07g08420基因在日本晴x9311中表现出了对胸腺嘧啶的抑制,该基因可能因为材料的不同而表现不同。综上,本研究结果说明胚乳中非印迹基因的表达方式和印迹基因的表达方式一样,是多样化的。既有表观遗传的DNA甲基化调控方式的参与,也有其他未知方式的参与。并且这些基因的表达同时还受材料和发育时期的影响,因此是一个比较复杂的调控。本研究的结果仅仅选取4个基因,为了得到更科学的结果,需要继续扩大基因的数目,针对DNA甲基化的调控方式,还需后期试验进一步分析其调控特点。