目的:有机磷类杀虫剂是农业生产中一种常见的农资。因其价低易得,效果显著,在世界范围内的农业生产中被广泛的应用。从某种意义上讲,有机磷的发明和使用,对保证世界各国的粮食生产和粮食安全,起到了非常重要的作用。但同时,我们也看到,在和有机磷相关的生产、运输和应用中,由于意外沾染和不当使用而造成的急慢性中毒时有发生。在一些以农业为主的不发达国家中,与有机磷相关的中毒案例甚至占据了自杀死亡案例的第一位。而且,在海湾战争、恐怖主义等事件的相关报导中,我们也可以看到诸如沙林、索曼、VX（propylamine ethyl methylthiophosphonate）等有机磷类神经毒剂的描述。有统计,全球每年因有机磷中毒和死亡的人数多达数百万。我国是农业大国,有机磷杀虫剂的使用仍然非常广泛。全国范围内,每年都有大量的各种原因所致的有机磷中毒的案例。因此,为了社会民生和国防安全的需要,有机磷中毒的解毒研究显得非常迫切。1953年,研究者发现人体内天然存在一种可以水解对氧磷的磷酸酯酶类,故命名对氧磷酶1（Paraoxonase PON1）。因其还具有在体内外对多种有机磷类化合物进行高效、无毒的水解作用,故而引起了相关研究的广泛关注。进一步的研究发现,PON1存在于多种哺乳动物体内,在肝、血、肾、脑等组织中均有分布。PON1在体内主要与高密度脂蛋白（high density lipoprotein HDL）结合,其构成的复合物既可以保护组织细胞免受毒素的侵害,也可防止低密度脂蛋白的过氧化^[1]。PON1是一种广谱的非专一性酯酶,可以水解芳香羧酸酯、有机磷酸酯以及氨基甲酸酯等多种化合物。研究表明,芳香羧酸酯是PON1的最适底物,PON1命名源于其能够水解有机磷酸酯的特殊毒理学意义。而且大量的研究还发现,PON1对某些有机磷类神经毒剂如索曼、沙林、塔崩和VX等也有着高效、无毒的水解作用,在有机磷中毒治疗的相关研究领域引起了广泛的关注。尽管人体内天然存在着PON1,但不同种族以及不同个体之间的PON1的活性差异比较大。个体间的PON1的活性差异甚至高达10-40倍。研究表明,这种表型的活性差异是由它的基因多态性所决定的。PON1的基因中存在的多态性位点多达几十个,但多为无意义的内含子。作为决定基因表型的外显子中,目前研究比较明确的PON1基因编码区的多态性位点有两个,即Leu55/Met（L55M）和Gln192/Arg（Q192R）。这两个位点的多态性非常显著的影响了体内的PON 1的浓度水平和对有机磷类化合物的催化水解效率^[14-18]。而且不同的基因亚型PON1的还具有不同的底物特异性。其中,PON1的R亚型个体对于敌敌畏、毒死蜱、对氧磷的中毒易感性低于Q型,而PON1的Q亚型个体对于二嗪农、沙林的易感性低于R型。这也就是说,PON1的192位点多态的亚型同工酶对于不同的有机磷毒物的水解效果存在着差异,甚至完全相反^[2]。在前期的实验中,我们曾经通过大肠杆菌表达系统获得重组的PON1。但是,原核细胞表达真核基因存在着缺乏翻译后修饰的缺陷,有可能使表达的蛋白因分子结构的部分缺失,造成酶活性的降低甚至丧失。而且,原核细胞所表达的蛋白分子容易大量聚合形成包涵体,会显著的影响最终的蛋白产量,极大的制约了后续的相关研究。Bac-to-Bac是一种昆虫细胞杆状病毒蛋白表达体系,可以很好的表达真核细胞基因,满足翻译后糖基化、磷酸化等需求,使得表达的蛋白在结构和功能上更接近天然蛋白。而且由于其可悬浮培养的特点,可以很好的保证产量的需求。因此本实验研究拟通过基因重组的方法,利用杆状病毒介导人PON1基因192位点多态的R/Q亚型基因转染给昆虫细胞,大量表达和获取活性强、产量高的重组人对氧磷酶1的R/Q192单基因亚型,并对其进行脱糖基化的相关研究,探索翻译后修饰对于PON1活性的影响。同时,对于不同基因亚型的PON1的解毒机制进行更有区别性和针对性的深入研究。研究方法:1、采用基因工程的方法制备和鉴定rhPON1的R/Q亚型同工酶。通过Gene Bank确定人血清对氧磷酶基因192位点多态的两种基因亚型（R/Q）,并进行有利基因转染的适度改造,使用全基因合成仪生成目标的亚型基因序列。将hPON1的（R/Q）基因亚型与载体pBacPAK8连接获得阳性表达载体。通过pBacPAK8质粒将目标基因转化至感受态的E.coli JM109细胞中,在JM109细胞内进行转座而得到含有rhPON1_R192和rhPON1_Q192基因亚型的杆粒DNA（Bacmid DNA）。通过多次培养,获得高滴度的杆粒病毒株。将高滴度的杆粒病毒株转染给IPLB-SF21细胞进行悬浮培养,大量获取rhPON1_R192和rhPON1_Q192基因亚型蛋白。对Western Blot检测正确的蛋白,进行钴琼脂糖层析柱亲和层析纯化。对于获取的纯化的目标蛋白,通过分光光度法检测和比较其酶活性,评价Bac-to-Bac的表达效果。2、研究脱糖基化对于rhPON1_R/Q192亚型同工酶的有机磷酸酯酶活性的影响。使用内切糖苷酶Endo F2对rhPON1_R192、rhPON1_Q192和混合人血清PON1(hPON1_mix)进行脱糖基化反应。选取有机磷农药:对氧磷、毒死蜱、二嗪农和三硫磷为底物分成四组,研究脱糖基化前后,rhPON1_R/Q192和hPON1_mix对这几种底物的体外水解活性的变化,并比较三者对于不同有机磷底物的水解活性的差异。采用Western Blot的方法,检测和比较rhPON1_R/Q192和hPON1_mix在脱糖基化前后,分子结构可能发生的变化及差异,探讨糖基化如何对hPON1_R/Q192的底物特异性产生影响。3.研究rhPON1的R/Q亚型同工酶对于有机磷染毒大鼠的中枢神经的保护作用研究。将Wistar大鼠108只随机分成对照组、毒死蜱染毒组、二嗪农染毒组和三硫磷染毒组。各组按照治疗的方案分成空白治疗亚组、rhPON1_R192治疗亚组和rhPON1_Q192治疗亚组,每个亚组9只大鼠。所有大鼠均采用灌胃染毒建立动物模型。各亚组中,按照毒物的1.5倍半数致死量（1.5×LD50）予以染毒。其中,对于rhPON1_R192治疗亚组和rhPON1_Q192治疗亚组,在染毒后1分钟内按照10U/kg的剂量分别予以尾静脉注射rhPON1_R192和rhPON1_Q192进行解毒。连续观察和记录各组大鼠的中毒症状出现的时间和程度,包括流涎时间、全身肌肉颤动时间、明显呼吸困难时间、肌力评分、死亡时间和死亡率等指标。连续观察12小时后,设定为实验终点。所有大鼠均采用断颈处死,即刻采血清和脑组织标本。采用分光光度法测定和比较染毒组和治疗组血清和脑组织的胆碱酯酶的活性变化;利用光镜和透射电镜观察和比较染毒组和治疗组中脑组织海马区神经元细胞及细胞核超微结构变化;Western Blot和免疫组化的方法检测和比较染毒组和治疗组中脑组织海马区的胆碱酯酶的表达情况,比较不同的PON1基因亚型同工酶对于不同有机磷毒物的底物特异性的差异,研究导致这种底物特异性的相关因素,进而找到对不同有机磷毒物进行高效水解的PON1基因亚型同工酶。结果:1、使用昆虫杆状病毒蛋白表达体系成功的大量表达PON1_R/Q192基因亚型同工酶,并获得高度纯化的目标蛋白。通过杆状病毒介导PON1_R/Q192基因亚型给昆虫细胞,成功表达PON1的192位点基因多态的两种亚型同工酶。采用Western-Blot检测分析确定是目标蛋白,分子量约43KD。而后对获取的蛋白进行钴琼脂糖亲和层析纯化。以对氧磷为底物,采用分光光度法检测rhPON1_R/Q192的有机磷酸酯酶活性。经测定,rhPON1_R192的酶活性达到152.5U/mL,产量达到了8.5%,纯化达435倍;而rhPON1_Q192的酶活性也达到了74.1U/m L,酶产量更是达到了12.5%,纯化达597倍。重组酶蛋白具有人血清对氧磷酶的生物学活性。2、经检测发现,脱糖基化对于rhPON1的R/Q亚型同工酶的活性有一定的影响。（1）我们发现在脱糖基化前,相同剂量的rhPON1_R/Q192与hPON1_mix对于不同的有机磷如毒死蜱、二嗪农、三硫磷等机磷农药表现出的水解活性并不一致,对毒死蜱的水解活性呈rhPON1_R192>hPON1_mix>rhPON1_Q192;而对于二嗪农的水解活性呈rhPON1_R192<hPON1_mix<rhPON1_Q192;对于三硫磷来说,rhPON1_R192、rhPON1_Q192和hPON1_mix的水解效果均不好。（2）我们发现,在使用内切糖苷酶Endo F2对rhPON1_R/Q192和hPON1_mix进行脱糖基化反应后,rhPON1_R/Q192和hPON1_mix对于多种有机磷毒物的水解活性均出现了明显下降,底物特异性降低。（3）在对这两种亚型进行Western Blot实验后。我们发现,脱糖基化后的rhPON1_R/Q192和hPON1_mix的分子量均有降低,降低的程度相近。3、rhPON1_R/Q192亚型同工酶对于不同有机磷染毒大鼠的神经保护作用具有差异。治疗亚组的大鼠一般状态好于对照组。治疗亚组的大鼠出现流涎、全身肌肉颤动、明显呼吸困难的时间,以及肌力评分达到3分的时间,与空白治疗亚组相比均发生延迟,差异有统计学意义。在rhPON1_R192治疗亚组中:毒死蜱染毒组的中毒症状弱于二嗪农和三硫磷染毒组,而在rhPON1_Q192治疗亚组,二嗪农染毒组的中毒症状弱于毒死蜱和三硫磷染毒组。三硫磷染毒组的中毒症状最重。各治疗亚组中大鼠的血清和脑组织的胆碱酯酶活性均高于空白治疗亚组,差异具有统计学意义。在Western Blot和免疫组化实验中,我们观察到各治疗亚组中脑组织海马区的胆碱酯酶表达水平高于对应的空白治疗组。在rhPON1_R192治疗的各亚组中,毒死蜱染毒组的各项关于胆碱酯酶检测结果,均好于二嗪农和三硫磷染毒组;在rhPON1_Q192治疗的各亚组中,二嗪磷染毒组的各项关于胆碱酯酶检测结果,均好于毒死蜱和三硫磷染毒组;三硫磷染毒组的各项检测结果最差。于光镜下观察发现,各染毒组的脑组织海马区神经元细胞出现异染色质,细胞呈空泡表现,甚至有细胞发生坏死,细胞带结构断裂、消失。电镜下可见神经元细胞的核膜出现切迹、模糊,核仁浓染边集,核糖体减少。而治疗各组的神经元细胞损伤程度均较轻。其中rhPON1_R192治疗的各亚组中,毒死蜱染毒组的脑细胞损伤程度最小,明显好于二嗪农和三硫磷染毒组,而rhPON1_Q192治疗的各亚组中,二嗪农染毒组的脑细胞损伤程度最小,明显好于毒死蜱和三硫磷染毒组。各治疗亚组中,三硫磷染毒组的脑细胞损伤程度最重,接近于空白治疗亚组。结论:1、通过昆虫杆状病毒蛋白表达体系可以大量表达生成高活性的rhPON1_R/Q192同工酶。所生产的rhPON1_R/Q192同工酶具有与人血清对氧磷酶1（hPON 1）相似的酶学活性特点,即以对氧磷为底物,rhPON1_R192的活性高于rhPON1_Q192,这种活性的差异同人群中的基因多态性分布一致,产生的原因可能与酶的分子结构有关。2、糖基化对于保持对氧磷酶的活性具有重要的作用。脱糖基化前,重组的hPON1_R/Q192和天然的hPON1表现出一致的底物特异性。脱糖基化后,重组型和天然型的对氧磷酶的分子量出现了一致性的下降,而且活性也都出现了明显的下降,这种活性的下降并不因底物的改变而发生变化,底物的特异性降低。3、PON1对P-O键的水解效果好于P-S键。这可能是由于P-S键相较于P-O键更牢固,使得含有P-S键的有机磷化合物更不易被PON1水解。4、rhPON1_R/Q192对于不同的有机磷农药染毒大鼠的脑神经具有一定的保护作用,通过减轻有机磷毒物对血清和脑组织的胆碱酯酶的抑制,起到保护中枢神经的作用。对于不同的有机磷农药中毒,rhPON1_R/Q192的治疗效果存在明显的差异。