研究背景糖尿病是影响人类健康的主要疾病之一。其治疗方法包括传统药物、胰岛素注射以及胰腺器官移植和胰岛移植等。胰腺器官移植技术复杂,围手术期并发症发生率较高,手术适应证仍局限于糖尿病合并肾功能衰竭需同时行胰肾联合移植者,目前仅在世界上比较大的移植中心开展。以胰岛移植为代表的细胞替代治疗具有手术易操作,创伤小的优点;而且与胰岛素注射治疗相比,胰岛移植物对机体血糖可实时监控,并及时释放胰岛素,维持机体的血糖稳定状态,防止糖尿病肾病、视网膜病变等并发症的发生。1999年埃德蒙顿(Edmonton)方案的实施使胰岛移植的疗效得到了显著提高,标志着糖尿病治疗进入了现代胰岛移植的全新阶段。但胰岛移植同样面临着供体来源受限的问题,加上移植围手术期技术和环境改变等因素造成的胰岛细胞大量死亡和功能损害,最终限制了胰岛移植在临床更大范围的应用。故扩大胰岛细胞来源成为近年胰岛移植研究领域的热点。有学者曾尝试采用异种胰岛移植(如猪)解决胰岛供体不足的矛盾,并且认为有可能避免1型糖尿病的自身免疫性攻击,但由于存在猪源性逆转录病毒感染的潜在危险,目前多数科学家认为只有在掌握人兽共患病机制之后,此项技术才能开展。为解决胰岛移植供体短缺的难题,近年来干细胞成为研究的热点之一。干细胞最显著的生物学特征是既具有自我更新、高度增殖的能力,又具有多向分化的潜能。按其来源可将它们分为胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESCs)和成体干细胞(Adult somatic stem cells,ASSCs)。胰腺干细胞(Pancreatic stem cell,PSCs)属于ASSCs,目前还没有明确的定义。一般是指未达终末分化状态,能产生胰岛组织或起源于胰岛,具有自我更新复制能力的未定型细胞。PSCs由于与胰腺内分泌细胞属于同一细胞谱系,分化成目标细胞的生物学步骤最短,被认为是最有希望作为临床胰岛移植的干细胞来源之一。其它优点包括:(1)具有高度增殖和多向分化潜能,能极大解决胰岛细胞来源不足的难题;(2)可通过胰腺活检获得自身的PSCs、干细胞建库、基因工程改造或修饰同种异体PSCs的方法避免或降低免疫排斥反应的发生;(3)避免了ESCs引起的无限增值而导致的肿瘤生长;(4)避免了应用ESCs带来的社会伦理问题。目前已有较多的研究对PSCs的细胞来源、培养、体外诱导分化、鉴定等进行了探讨。由于PSCs的研究尚处于起步阶段,各种方法差别较大,还没有一套公认的的培养、诱导分化及鉴定方案。另外,由于体外条件下无法模拟促使干细胞发育成熟的体内环境,致使大多数研究不能获得真正成熟的胰岛细胞,不能够完全逆转动物的高血糖状态。因此,我们设计本实验,确立一种简单有效的培养、鉴定PSCs的方案;鉴于体内微环境有促进PSCs发育成熟的刺激信号、营养物质和因子,我们也试图寻找促使PSCs发育成熟的最佳体内环境,也就是使PSCs发挥最佳的治疗糖尿病的效果。目的(1)探索从新生Wistar大鼠胰腺组织中分离、培养胰腺干细胞并进行鉴定以及体外诱导分化的方法。(2)探讨并比较不同分化状态的胰腺干细胞(未分化细胞和经体外诱导方案诱导分化的细胞)经两种移植途径(分别经门静脉和肾包膜下移植)对糖尿病大鼠的治疗效果。方法(1)取新生Wistar大鼠的胰腺组织,经胶原酶消化成组织碎片,转入含有RPMI1640高糖培养基(含33.3mM的Glu,并添加了10%FBS、20ng/ml EGF,20ng/ml bFGF)的培养瓶(预先用鼠尾胶原处理)中进行原代和传代培养:使用无血清RPMI1640低糖培养基(含11.1mM的Glu,撤去EGF、bFGF和FBS,另添加10mM尼克酰胺,71.5uMβ—疏基乙醇)对培养细胞诱导分化。以扫描与透射电镜观察细胞的超微结构形态;免疫荧光法检测胰岛素、胰高血糖素、PDX-1、CK-19以及Ngn3等抗原的表达;双硫腙染色检测干细胞分化前后β细胞比率;放免法测定细胞胰岛素分泌水平;PCR技术检测PDX-1 mRNA、CK-19mRNA、Ngn-3 mRNA和胰岛素mRNA的表达情况。(2)取Wistar大鼠50只,经尾静脉一次性注射链脲佐菌素(60 mg/kg bodyweight),随机血糖＞16.7mM并持续稳定1周为造模成功。然后将成模大鼠随机分为5组:A组(n=5,对照组,经门静脉注射生理盐水)、B组(n=10,经门静脉移植未分化PSCs)、C组(n=10,经门静脉移植已分化细胞)、D组(n=10,肾包膜下移植未分化PSCs)和E组(肾包膜下移植已分化细胞)。移植术后监测大鼠的随机血糖、体重和胰岛素的变化;移植后13天和28天行经腹腔注射的葡萄糖耐量试验;术后14天和30天分两批处死全部大鼠,取A、B、C三组大鼠的肝脏和D、E两组大鼠的肾脏做病理切片和免疫组织荧光染色,测量体内“类胰岛结构”的直径、观察其形态以及胰岛素表达的情况。结果(1)胶原酶消化法联合使用高糖培养基可有效分离得到纯化的胰腺导管上皮细胞。培养细胞具有高度增值能力,电镜下呈未分化细胞特征,同时表达PDX-1和CK-19,随着传代次数增加,部分细胞表达Ngn3;但该种细胞不表达胰岛素和胰高血糖素,双硫腙染色和胰岛素分泌实验未证实有胰岛素阳性细胞。分化培养后,部分细胞可表达胰岛素和胰高血糖素,双硫腙染色阳性细胞比率为25±6%,胰岛素反应能力提高,对10～30mM浓度的糖浓度刺激具有反应。(2)50只Wistar大鼠48只造模成功,成模率为96%。细胞移植术后第6天至第18天,B组糖尿病大鼠血糖与对照组相比差异有显著性意义,术后14天时血糖曾降至正常范围;C、E两组血糖变化趋势基本相同,与对照组两两相比,第4天时血糖浓度差异有显著性意义,但持续时间较短,且整个过程中未见血糖恢复至正常范围。D组与对照组相比,直到实验结束时两组血糖差异无显著性意义。经腹膜腔注射的葡萄糖耐量试验显示B组细胞移植物移植后13天具有较强的抗高血糖效应。形态学观察发现未分化胰腺干细胞可以在大鼠肝脏内(B组)诱导分化为较大的“类胰岛样结构”,直径多在150～200μm左右,胰岛素染色阳性细胞较密集,而C、E两组以直径50μm左右较小的“类胰岛样结构”居多,胰岛素染色阳性细胞较稀疏。免疫组织荧光染色显示B组类胰岛样结构中有较多的BrdU阳性细胞。结论(1)本研究利用胶原酶消化法得到的细胞具有高度增值能力和分化成胰岛细胞的潜能,经多种实验技术方法证实是来源于导管上皮的胰腺干细胞。低糖培养基的条件下,有助于胰腺干细胞的分化成熟。(2)经过体外条件诱导分化的胰腺细胞移植入肝脏内和肾包膜下能进一步分化成熟,以较小的“类胰岛样结构”为主;而未分化的胰腺干细胞在肝内微环境和高血糖刺激下能够诱导分化为更为成熟的较大的“类胰岛样结构”,并且能短暂的完全逆转糖尿病大鼠的高血糖。胰腺干细胞定向分化为内、外分泌细胞的潜能有助于内分泌细胞的进一步成熟。