目的：迄今为止,大多数临床研究采用混杂的自自体骨髓单个核细胞用于心肌再生治疗,且尚无足够证据表明某种特定干细胞的再生疗效优于其它种类干细胞。探索安全、符合伦理、且增殖分化潜能显著的新型干细胞代表了心肌再生医学未来的发展方向之一。极小类胚胎样干细胞(VSELs)是近年来发现的成体多能干细胞,具有与胚胎干细胞相似的增殖分化潜能,有固定的表面抗原标记,且无免疫排斥及伦理争议等问题,故可用于临床。由于体积小,数量少,采用常规分选方法易损失大部分VSELs。本研究拟探索VSELs的优化分选方法,提高其分选效率并保持其生物学特性。方法：本实验分为两组。采用雄性C57BL/6小鼠,4-6周龄,分离股骨和胫骨,冲洗骨髓腔获得小鼠全骨髓细胞。A组将全骨髓细胞接种培养,经换液去除悬浮细胞,培养至接种后第6-7天收集剩余细胞。B组将收集的全骨髓细胞经裂解去除红细胞后,得到骨髓单个核细胞。将以下荧光标记抗体预混并稀释至相应浓度：PE-Sca-1,FITC-CD45及APC-lineage (anti-CD45R/B220、anti-Gr-1、anti-TCRβ、Chain、anti-CDllb及anti-Ter119).收集A、B两组细胞,加至抗体中孵育20分钟；以密闭无菌的流式细胞仪分选VSELs[sca-1(+)、lineage(-)/CD45(-)]。透射电镜下观察VSELs超微结构,RT-PCR检测相关基因表达水平。结果：两组相比,A组经短期体外培养后,骨髓干细胞中sca-1(+)、CD45(-)亚群细胞比例(89.6±1.99%,22.9±1.84%)均显著高于B组(16.53±0.54%,0.91±0.11%；P均<0.001)；A组lin(-)亚群细胞比例(51.1±3.6%)也显著高于B组(34.7±3.0%,P=0.023)；A组分选得到的sca-1(+)、lin(-)、CD45(-) VSELs比例(9.4±0.62%)显著高于B组(0.04±0.01%,P<0.001)。透射电镜扫描可见两组分选的VSELs细胞大小、形态及内部超微结构均无明显差别,提示短期体外培养并未影响VSELs的生物学特性。定量RT-PCR结果显示,A组细胞少量表达胚胎干细胞特异性基因Oct-4、Nanog,以及心肌细胞特异性基因Gata4.Nkx2.5:B组表达极低水平的Oct-4及Nanog,无Gata4. Nkx2.5基因表达。结论：全骨髓细胞短期体外培养能够有效地扩增VSELs,并保持其生物学特性。目的：骨髓间充质干细胞(Mesenchymal stem cells, MSCs)是移植治疗急性心肌梗死理想的供体细胞之一,但心肌梗死后心肌局部微环境异常恶劣,不利于移植细胞在体存活并发挥作用。本课题组前期研究已证实他汀类药物可通过改良梗死后心肌局部微环境提高MSCs移植疗效,但他汀类药物是否对MSCs自身发挥保护作用尚不明确。JAK激酶-信号转导和转录激活因子(Janus kinase-signal transducers and activators oftranscription, JAK-STAT)信号通路是细胞因子信号传导的重要途径,广泛参与多种细胞的生理病理过程。本研究拟采用体外缺氧/无血清(Hypoxia/Serum-deprivation, H/SD)培养条件模拟梗死后微环境并诱导大鼠骨髓MSCs凋亡模型,探讨瑞舒伐他汀(ros uvas tatin, Rosu)对MSCs的保护作用,并深入研究JAK-STAT信号通路在其中的作用。方法：体外培养条件下,大鼠骨髓MSCs分常氧对照组、H/SD对照组、不同浓度梯度(0.001μM-1OμM) Rosu处理组、JAK2阻断剂AG490 (lμM)处理组以及Rosu (1μM)加AG490 (1μM)联合处理组。流式细胞仪检测各组MSCs的凋亡比例,Western blot法检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2水平及JAK2、STAT3、eNOS蛋白表达及磷酸化水平。结果：流式细胞仪分析显示,与常氧组比较,H/SD组MSCs早期凋亡率显著升高(44.49±3.43% vs.4.55±1.98%,P=0.000)。0.01-lOμM Rosu处理组MSCs早期凋亡率(25.45±5.72%、18.47±4.31%、17.62±3.6%、24.99±3.85%)均显著低于H/SD组(P均<0.01),不同浓度梯度间相比无显著性差异(P均>0.05)。而0.001μM Rosu处理组MSCs早期凋亡率(43.07±6.56%,P>0.05)与H/SD组相比无显著性差异。与H/SD组相比,单纯1μM AG490处理对MSCs早期凋亡率无显著影响(37.7±4.08% vs.44.49±3.43%,P>0.05),而1μM Rosu加用1μMAG490后细胞早期凋亡率高于单纯Rosu组(34.81±4.08%vs.17.62±3.6%,P=0.000),但低于H/SD组(34.81±4.08% vs.44.49±3.43%,P<0.01)。Western Blot结果显示,H/SD组Bax、Bcl-2水平较常氧对照组显著升高(P<0.05)；与H/SD组Bax水平比较,0.1μM与1μM Rosu处理组显著低于H/SD组(P<0.05),其余Rosu浓度组无显著差异(P>0.05)；与H/SD组Bcl-2水平比较,0.01μM-lOμM Rosu组均显著增加(P均<0.01)。与单纯1μM Rosu相比,Rosu加用AG490后Bcl-2表达水平降低(P<0.05),而Bax表达水平增加(P<0.01)。与H/SD组比较,0.01-10μM Rosu处理组JAK2, STAT3磷酸化水平明显升高(P<0.01); eNOS磷酸化水平在0.001μM(P<0.05)和1OμM (P<0.01) Rosu组显著增高。与单纯1μM Rosu组相比,1μM Rosu加入AG490后可显著抑制JAK2、STAT3及eNOS蛋白的磷酸化水平。结论：1Rosu 1可抑制缺氧无血清培养条件诱导的MSCs凋亡,从而提高其存活率；2. JAK2-STAT3-eNOS信号通路介导了Rosu对MSCs的保护作用。目的：急性心肌梗死后心肌局部微环境恶劣,移植到体内的干细胞存活率低,进而限制了干细胞移植的治疗效果。我们既往的研究初步表明,围梗死期给予小剂量他汀类药物能够减轻梗死心肌局部的炎症、氧化应激和凋亡损伤,提高移植的骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)存活,并改善心功能。然而,他汀类药物改良梗死心肌局部微环境的具体机制仍不明确。方法：将200只雌性SD大鼠随机分为5组(n=40)：对照组(control);瑞舒伐他汀组(R组)；MSCs移植组(M组)；瑞舒伐他汀与MSCs移植联合组(M+R组)；以及瑞舒伐他汀+MSCs移植+JAK2抑制剂AG490处理组(M+R+AG组)。采用结扎冠状动脉前降支的方法制作急性心肌梗死模型,梗死后1周在梗死中央区及梗死周边区心肌内多点注射MSCs (2xlO6cells),对照组动物注射等体积培养液。在梗死后1周(基线)及MSCs移植后4周(终点)分别行心脏超声检测。MSCs移植后4周处死动物,取心脏组织,分别行病理组织学及分子生物学检测。结果：MSCs移植后4周,心脏超声显示,与对照组相比,左室舒张末期内径(LVEDd)和左室收缩末期内径(LVESd)仅在M+R组显著减小(P<0.001),而在R组、M组及M+R+AG组均无显著差异(P均>0.05)；左室射血分数(LVEF)和左室短轴缩短率(LVFS)在M组(P<0.05)及M+R组(P<0.001)均显著增加,且增加程度在M+R组也显著高于M组(P<0.001)。心肌组织Masson’s Trichrome染色显示,各组均有左室心肌透壁性梗死。与对照组相比,仅M+R组左室纤维化面积明显减小(8.4%±1.8% vs.18.3%±2.8%,P<0.001)；而R组(17.7%±2.1%,P>0.05)、M组(16.1%±2.0%,P>0,05)及M+R+AG组(16.5%±1.9%,P>0.05)均无显著差异。与其他各组相比,M+R组存活心肌比例增多,梗死周边区细胞外基质聚集及纤维化减少。以Real-Time PCR定量检测MSCs移植各组心肌组织中SRY基因水平,评价干细胞存活率。结果显示,尽管各组移植干细胞存活率均较低,而在M+R组(8.90%±0.74%)明显高于M组(2.31%±0.20%,P<0.001)及M+R+AG组(3.89%±0.33%,P<0.001)。与对照组相比,梗死交界区毛细血管密度在M+R组显著升高(21.72±1.40 vs8.54±0.61,P<0.005),而在R组(13.90±1.01)及M组(9.28±0.80)均无显著差异(P均>0.05)；且M+R组均显著高于R组、M组及M+R+AG组(9.57±0.82,P均<0.005)。与对照组相比,梗死中央区毛细血管密度在M+R组亦显著升高(19.40±1.12 vs.5.20±0.51,P<0.005),而在R组(11.13±0.9)及M组(7.22±0.63)均无显著差异(P均>0.05),而M+R组显著高于R组、M组及M+R+AG组(6.20±0.45,P均<0.05)。免疫组织荧光染色显示,部分移植的MSCs表达心肌肌钙蛋白Ⅰ,且MSCs分化效率在M+R组显著高于M组以及VI+R+AG组。Western Blot结果显示,对照组及各治疗组均显示心肌内JAK2及STAT3蛋白激活。与对照组相比,p-JAK2、p-STATl及P-STAT3水平在R组及M+R组显著升高(P均<0.001),而在M组无显著差异(P>0.05)；与M+R组比较, p-JAK、p-STATl及P-STAT3水平在M+R+AG组显著降低(P<0.001)。结论：1.瑞舒伐他汀联合MSCs移植能够明显增强MSCs的移植疗效,减轻梗死后炎症及纤维化,促进MSCs向心肌细胞分化效率及新生血管生成作用,改善心脏功能,并抑制心肌梗死后左室重塑。2.瑞舒伐他汀通过激活JAK2-STAT3信号通路,增加心肌内移植的MSCs存活,进而增强其生物学疗效。