卵巢功能减退(Diminished ovarian reserve,DOR)是指卵母细胞数量或质量的下降,其病因复杂,目前除随年龄增长引起的生理性卵巢功能减退外,大多数病因仍不明确,而DOR进一步发展,可导致卵巢早衰(Premature ovarian failure,POF)。目前DOR临床治疗主要采用激素替代疗法,但不能从根本上恢复患者卵巢功能,且辅助生殖治疗成功率较低。干细胞治疗能够改善和修复受损组织的功能,目前已在多个领域开展临床应用,是非常具有潜力的治疗方法。骨髓移植治疗提示,干细胞具有修复卵巢功能的作用;而动物实验表明移植进入受体的干细胞并不能分化为新的卵母细胞。探讨干细胞在改善卵巢功能中的治疗应用及作用机制,将为DOR的研究与治疗开辟新的领域。本研究建立多种不同性别的干细胞系,收集干细胞培养上清,然后通过尾静脉注射方式给予32周C57BL/6雌性小鼠(DOR模型),观察其生殖功能:通过分析受治小鼠血清性激素水平、获卵数及卵巢内各级卵泡数的差异,比较各类培养上清对卵巢功能的改善效果;通过RT-PCR、ELISA等实验进一步比较各类培养上清中干细胞分泌因子的差异,初步探讨干细胞治疗DOR的可能机制。本研究为探讨干细胞分泌因子对卵巢功能改善的作用及其机制积累了研究资料,为干细胞治疗DOR时种子细胞的选择提供了理论依据。材料与方法1.建立多种不同性别的干细胞系:根据本实验室前期建立胚胎干细胞系的方法建立新细胞系。通过酶消化法建立羊膜间充质干细胞系;通过组织培养建立脐带间充质干细胞系。2.细胞系的鉴定:通过免疫荧光、拟胚状体形成检测hESC的多能性,基因测序检测其染色体核型。通过流式检测MSC的表面标志物,在体外经诱导分化检测MSC向中胚层分化潜能,遗传标志检测-STR图谱检测MSC的染色体核型。3.细胞培养上清质量检测:通过ELISA试剂盒按说明书检测各上清中相关细胞分泌因子。4.DOR模型的选择及分组:选用32周龄C57BL/6的雌性小鼠,分成九组,通过尾静脉分别注射生理盐水、不同的干细胞培养液和不同的干细胞培养上清。5.小鼠卵泡数目统计:各组小鼠结束尾静脉注射干细胞培养上清后,腹腔注射PMSG 48h后,腹腔注射HCG,14-16h后处死小鼠,取输卵管壶腹部计数各组小鼠排卵数,同时摘取各组小鼠卵巢,经石蜡切片、HE染色后计数卵巢内各级卵泡数目。6.小鼠性激素水平检测:通过ELISA试剂盒检测各组小鼠血清中E2、FSH和AMH水平。7.卵巢颗粒细胞凋亡检测:通过Tunel试剂盒检测。8.不同种类、不同性别干细胞分泌因子水平的比较:通过实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析干细胞分泌细胞因子水平,包括趋炎因子、抑炎因子、生长因子、基质金属蛋白酶及其抑制剂、血管生成因子、白血病抑制因子以及骨形成蛋白4。结果一、建立多种干细胞系1.hESC的建系及鉴定成功建立新的细胞系CCRM15。细胞呈典型的克隆状生长,边界明显,核大、核仁清楚,核质比高;表达多能性标志物OCT-4、NANOG和SSEA-4,能在体外培养时形成拟胚状体;同时测序结果表明其染色体核型为46,XX。2.MSCs的建系及鉴定成功建立AMSC及UMSC各两株,分别命名为AMSC2.2.2(46,XY)、AMSC1.2.2(46,XX)和 UMSC2.2.2(46,XX)、UMSC4.2.2(46,XY)。.细胞形态均为梭形的成纤维细胞样,呈放射或旋涡状生长,体外扩增能力强。细胞表面因子表达水平表明AMSCs、UMSCs均符合质量鉴定标准。体外诱导分化实验显示各细胞系均具有成脂、成骨、成软骨分化能力。二、干细胞培养上清改善小鼠卵巢功能2.1尾静脉注射不同干细胞培养上清后小鼠血清性激素水平的比较尾静脉注射MSC细胞培养上清组小鼠血清E2水平均高于对照组,且上升幅度为:男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>PLT培养基组>生理盐水组,且 AMSC2.2、AMSC1.2.2、UMSC2.2.2、UMSC4.2.2 均与生理盐水组存在显著性差异(p<0.05、p<0.001、p<0.05、p<0.001),同时 AMSC2.2.2 及 UMSC4.2.2与PLT培养基组间有显著性差异(p<0.01、p<0.001),但hESCs组,即CCRM15上清组、CCRM22上清组中E2浓度与对照组相比均无明显差异。尾静脉注射不同干细胞培养上清后,各组小鼠血清FSH水平均有下降趋势,下降幅度为:男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>培养基对照组>生理盐水组;且hES细胞培养上清组与hES培养基组间存在显著性差异(p<0.05),MSCs组与生理盐水组间存在显著性差异(p<0.01)。尾静脉注射不同干细胞培养上清后,各组小鼠血清AMH水平有升高趋势,升高幅度为:男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组;且除hES培养基、CCRM22细胞培养上清组外其余各组与生理盐水组比较均存在显著性差异(p<0.05)。2.2尾静脉注射不同干细胞培养上清后小鼠卵泡数的改变在显微镜下计数各组小鼠排卵数目,发现注射干细胞培养上清的各组小鼠获卵数>对照组,且有男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>干细胞培养基组的趋势,其中 CCRM15、CCRM22、AMSC2.2.2、UMSC2.2.2 和 UMSC4.2.2细胞培养上清组与生理盐水组间存在显著性差异(p<0.05),同时CCRM15、CCRM22细胞培养上清组与hES培养基组间液分别存在显著性差异(p<0.05)。治疗组、对照组小鼠卵巢经石蜡包埋、切片、HE染色后在正置显微镜下观察,发现各组小鼠卵巢内均存在各级卵泡,且其数目存在一定的差异趋势。治疗组小鼠的卵泡数均有明显升高,其中初级、窦卵泡数的升高幅度为:男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组;始基卵泡数上升幅度在hESCs、UMSCs细胞培养上清组中为:男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组,而在AMSCs上清组中则为女性细胞培养上清组>男性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组;次级卵泡数上升幅度在hESCs细胞上清组为女性细胞培养上清组>男性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组,在MSCs细胞上清组中均为男性细胞培养上清组>女性细胞培养上清组>干细胞培养基组>生理盐水组。2.3尾静脉注射不同干细胞培养上清后小鼠卵巢颗粒细胞凋亡比较Tunel检测发现治疗组颗粒细胞凋亡率低于对照组。三、干细胞分泌因子的研究实时荧光定量聚合酶链反应(Real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)分析干细胞分泌细胞因子水平发现女性UMSCs分泌生长因子(SCF、vEGF、BDNF、HGF)、血管生成因子(angiogenin)、造血因子(LIF)、促炎因子(IL-10)等的能力显著强于 hESCs、AMSCs(p<0.05);女性 hESCs、男性 UMSCs分泌金属蛋白酶的水平显著高于其它干细胞(p<0.05)。结论:1.本研究成功建立了胚胎干细胞系CCRM15(46,XX),脐带间充质干细胞系UNSC2.2.2(46,XX)、UMSC4.2.2(46,XY),羊膜充质干细胞系 AMSC2.2.2(46,XX)、AMSC1.2.2(46,XY)。各细胞系生长状态均良好,且符合各类型干细胞的鉴定标准,可用于后期研究。2.本研究采用年龄导致生理性卵巢功能减退的小鼠作为DOR模型,并经尾静脉注射不同种类、不同性别干细胞培养上清研究干细胞治疗DOR效果。发现:干细胞培养上清治疗后小鼠性激素水平上升,卵巢内各级卵泡数目、最终获卵数均增加,表明干细胞分泌因子可改善卵巢功能,提示干细胞治疗效果可通过分泌细胞因子来实现;另外,男性MSC培养上清治疗组的各种检测数据均高于其它治疗组,提示卵巢功能改善效果具有细胞类型、细胞性别依赖性,潜在的机制有待后期进一步研究。我们的研究对于选择合适类型的干细胞作为DOR治疗的种子细胞具有重要参考价值。3.本研究通过比较各类干细胞培养上清中分泌因子浓度,发现不同种类、不同性别干细胞分泌细胞因子的能力存在一定差异,因而导致干细胞治疗的效果存在差异:女性UMSCs可能具有更好的促进细胞生长、改善血供的能力;而女性hESCs、男性UMSCs则可能具有更强的降解结缔组织的能力。该研究结果对于选择合适类型的干细胞作为具体疾病的种子细胞具有重要参考价值。