古菌的Cdc6蛋白与真核生物ORC复合物的Orel亚基和细胞分裂控制蛋白Cdc6都具有一定的相似性。在已经测序完成的古菌中,除甲烷球菌和甲烷火菌外,其他种类的古菌都含cdc6基因,并且大部分种类含有至少2个cdc6基因。本文的研究对象冰岛硫化叶菌有3个cdc6基因,分别为cdc6-1、cdc6-2和cdc6-3,cdc6和cdc6-3参与DNA复制起始,而cdc6-2则功能未知(Samson et al.2013)。有文献报道UV处理硫磺矿硫化叶菌后,cdc6-1和cdc6-3的表达量下降,而cdc6-2的表达量大大增加(FroLs et al 2008;Gotz et al 2007)。因此作者推测Cdc6-2蛋白可能参与宿主DNA损伤后的修复或信号传导。本文围绕古菌模式菌株冰岛硫化叶菌Rey15A中Cdc6-2蛋白进行了一系列遗传和生化研究,现已取得以下几个方面的成果:(1)使用不同浓度的DNA损伤试剂4-NQO处理野生型菌株以及缺失cdc6-2的突变株,结果表明缺失cdc6-2基因的突变株对与4-NQO更加敏感。构建回补质粒将cdc6-2基因回补到缺失菌株中发现细胞对于4-NQO的耐受性增加,而超表达Cdc6-2蛋白后,菌株的生长收到抑制。(2)以不同的4-NQO处理时间进一步研究4-NQO对cdc6-2转录量和表达量的影响。实验结果显示,在4-NQO处理5h后,cdc6-2mRNA转录量提高约25倍,蛋白表达量提高约16倍。因此,cdc6-2表现出强烈的DNA损伤应答。(3)使用生物信息学分析定位cdc6-2全长启动子,并将全长启动子以及3个不同长度的截短启动子插入到冰岛硫化叶菌常用的LacS报告基因质粒中,将4个报告基因质粒分别转入野生型菌株与缺失cdc6-2基因突变株,检测转化子β-半乳糖苷酶活性。实验结果显示,cdc6-2启动子上存在一个DNA损伤应答原件(DDRE1),并且DNA损伤应答对cdc6-2的调控需要DDRE1以及cdc6-2基因的共同存在。(4)设计凝胶迁移实验和足迹分析实验验证Cdc6-2蛋白与自身启动子结合并调控自身基因的表达。凝胶迁移实验结果显示Cdc6-2特异性结合自身启动子,足迹分析实验鉴定出一段位于DDRE1区域中被Cdc6-2蛋白所结合的长度为29bp的DNA(-66到-38)。(5)对被Cdc6-2蛋白结合的这段序列进行突变,将不同位点突变的启动子用于足迹分析实验和报告基因实验。结果发现了核心结合位点(-58到-46)的存在,并且核心结合位点对于Cdc6-2蛋白的体外DNA结合活性是必须的,体内实验结果揭示Cdc6-2蛋白的DNA损伤诱导表达同样需要核心启动子存在。综上,冰岛硫化叶菌中Cdc6-2蛋白可以调节细胞对于DNA损伤剂的耐受性并且这种调节涉及到Cdc6-2蛋白对于自身启动子的结合。