论文部分内容阅读
背景： 乙型肝炎病毒（HBV）是危害人民健康的重要疾病。目前，核苷（酸）类似物（NA）是有效控制慢性乙型肝炎病情进展的主要临床用药，但长期用药容易导致药物作用靶位HBV逆转录酶（RT）区产生耐药变异，极大地限制了其抗病毒疗效。目前研究发现与核苷（酸）类似物耐药相关的变异位点包括拉米夫定为M204V／I、L180M、V173L、A181T、v207I；阿德福韦为N236T、A181V／T；恩替卡韦为M250V+I169T+M204V+L180M、T184G+S202I+M204V+L180M。除了常见的NA耐药变异形式，RT区产生的新变异也值得我们关注。 目的： 本研究对一例NA序贯治疗的慢乙肝患者血清HBV逆转录酶（RT）区产生的新变异rtA181C进行鉴定并分析其表型特点，为临床合理制定抗HBV治疗方案提供依据。 材料与方法：本研究的血清样本取自2010年6月解放军第302医院确诊的慢性乙型肝炎患者，男43岁，排除其他因素所致肝功能损害。HBV血清学检测显示：HBsAg、HBeAg、HBcAb均阳性。提取患者血清中HBV DNA，巢式PCR扩增HBV RT全基因，PCR产物直接双向测序结合克隆测序分析HBV RT区12个耐药相关突变位点。构建代表性克隆重组表达载体pTriEx-HBV1.1，提纯质粒瞬时转染人肝癌细胞系HepG2细胞，转染4h后加入不同浓度拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦和替诺福韦，转染96h后采用实时荧光定量PCR检测不同药物浓度作用下培养细胞上清中HBV DNA复制水平并分析其表型耐药特点。 结果： 此例慢乙肝患者序贯接受拉米夫定治疗36个月→阿德福韦治疗14个月→恩替卡韦治疗29个月，而后发生病毒突破，HBV DNA由阴性升高到1.1×106IU/mL，转氨酶由正常升高到235 U/L。直接测序显示HBV RT基因rtL180M+rtA181V+rtM204V变异，克隆测序得到18个克隆，其中9个为rtL180M+rtA181V+rtM204V变异株，1个为rtV173L+rtL180M+rtA181V变异株，7个为rtL180M+rtA181C+rtM204V变异株，1个为野生株。病毒复制力检测结果从高到低依次为：野生株>rtV173L+rtL180M+A181V>rtL180M+rtA181C+rtM204V>rtL180M+rtA181V+rtM204V。表型耐药分析显示：与野生株比较，rtL180M+rtA181V+rtM204V变异株和rtV173L+rtL180M+rtA181V变异株对拉米夫定和阿德福韦不敏感，rtL180M+rtA181C+rtM204V变异株对拉米夫定和恩替卡韦不敏感。 结论： 长期核苷（酸）类似物（NA）序贯治疗可引起多重耐药发生；rt181位点新的变异rtA181C与恩替卡韦长期用药相关，可能是新的恩替卡韦耐药位点。