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屎肠球菌HDRsEf1菌株是从我国地方优良品种“通城猪”直肠内容物中获得的优良益生菌株,具有降低仔猪腹泻率、提高仔猪生长性能和增强肠道屏障等优点。已有研究发现HDRsEf1能保护IPEC-J2细胞的完整性,降低IPEC-J2细胞IL-8的分泌,其抑炎效应与其胞外多糖EPS有关,这为HDRsEf1抑制炎症效应、维持机体肠道稳态机制研究提供了必要依据。已有HDRsEf1体外抑炎效应的研究结果来自猪肠上皮细胞系,而单一的肠上皮细胞系只能在一定程度上模拟动物肠道,因此,本研究选取肠道中的肠上皮细胞及下层处于免疫核心地位的DC、CD4+T细胞,构建3种细胞共培养模型来模拟肠道细胞互作,从HDRsEf1直接或间接刺激的DC对CD4+T细胞定向分化影响的角度,来阐明屎肠球菌HDRsEf1及其胞外多糖的抑制炎症效应机制。为了使肠上皮细胞可能具有的作用、肠上皮细胞与DC的互作效应得到显现,细胞共培养模中DC接受益生菌刺激的形式进行了三种设计,分别称为直接组(HDRsEf1或EPS直接刺激BMDC)、间接组(HDRsEf1或EPS刺激MODE-K上清处理BMDC)、Transwell组(MODE-K和BMDC分处上下室,HDRsEf1或EPS刺激上室中MODE-K)。主要研究内容及结果如下: (1)通过HDRsEf1及EPS对MODE-K跨膜电阻(TEER)的影响和细胞毒性试验,分别确定HDRsEf1刺激DC的剂量为1×107CFU、APS和NPS的使用剂量分别是25μg/mL、25μg/mL和50μg/mL;从小鼠骨髓中诱导培养小鼠BMDC,将第5d未成熟BMDC用于后续试验;从小鼠脾脏经免疫磁珠分选出初始CD4+T细胞,流式鉴定纯度高达99%,为共培养细胞模型奠定基础。 (2)HDRsEf1对BMDC成熟和其细胞因子的影响。在直接组,HDRsEf1能促进BMDC成熟,而间接组和Transwell组,HDRsEf1能抑制BMDC的成熟。在直接组HDRsEf1能显著上调其促炎因子IL-1β和TNF-α的分泌,在间接组和Transwell组,HDRsEf1能抑制促炎因子IL-1β分泌、上调IL-10和TGF-β的分泌。提示HDRsEf1在机体肠道中可通过DC直接发挥抑炎效应。 (3)HDRsEf1刺激的BMDC对CD4+T细胞定向分化的影响。在直接组,HDRsEf1促进CD4+T细胞向Th1和Th2型的分化,且Th1型占主导地位,达到30.4%;在间接组,HDRsEf1并不促进CD4+T细胞向Th1、Th2和Th17型的分化;在Transwell组,HDRsEf1显著抑制CD4+T细胞向Th1亚型和Th17亚型分化、促进CD4+T细胞向Th2型分化,Th2的比例达16.6%。提示HDRsEf1在机体肠道中可通过DC诱导CD4+T细胞的定向分化,间接发挥抑炎效应。 (4)HDRsEf1的EPS对BMDC成熟和其细胞因子的影响。在直接组25μg/mL APS和50μg/mL NPS促进BMDC成熟,上调其IFN-γ,IL-12和TGF-βmRNA的表达,上调IL-1β,IL-6,TNF-α等促炎因子的分泌。间接组25μg/mL APS和50μg/mL NPS均能抑制BMDC成熟,抑制IL-12,IFN-γmRNA表达,抑制IL-1β和MCP-1的分泌。在直接组25μg/mL APS和NPS均能显著促进BMDC成熟,上调促炎因子IL-lβ、IL-6和TNF-α的分泌;在间接组和Transwel1组两者均能抑制BMDC表面分子的表达、显著抑制促炎因子分泌。提示HDRsEf1的EPS在机体肠道中可抑制DC的成熟,并通过DC直接发挥抑炎效应。 (5)HDRsEf1的EPS刺激BMDC对CD4+T细胞定向分化的影响。25μg/mL APS和NPS在三个组中均显著抑制CD4+T细胞分化。提示HDRsEf1的EPS在机体的肠道内能通过DC抑制CD4+T细胞的增殖分化。 在益生菌HDRsEf1对肠道甚至全身的免疫调节中,肠上皮细胞可能通过其分泌的细胞因子与下层DC互作,在调节机体免疫稳态中发挥重要作用。