目的 构建汉坦病毒（hantavirus,HV）莒南扩增株JUN05株核衣壳蛋白（nucleocapsid protein,NP）的荧光蛋白表达载体;将HV NP基因与EGFP基因在BHK21细胞中融合表达,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达强度,以及融合蛋白在细胞中定位和分布,免疫组化观察融合蛋白的免疫反应性,从而为新型HV诊断试剂研制与开发,以及NP结构与功能的研究奠定基础。 方法 根据HV莒南扩增株JUN05株NP基因的序列和表达载体pEGFP-N1的多克隆位点序列,设计引物,通过PCR的方法扩增NP全基因。PCR产物回收后以核酸内切酶BglⅡ、PstⅠ双酶切,克隆至同样双酶切的pEGFP-N1载体上,并保持NP基因与EGFP基因的读码框一致,CaCl₂法转化并筛选阳性克隆。通过PCR方法和双酶切方法鉴定,并通过DNA测序技术最终鉴定表达载体的构建情况。将重组质粒以脂质体法转染BHK21细胞,转染24h后固定细胞,荧光显微镜检和免疫组化技术观察融合蛋白的表达并拍照记录。 结果 1.构建了含有HV NP基因的荧光蛋白表达载体,酶切鉴定、PCR鉴定、及测序结果表明载体构建成功。 2.测序结果表明,NP基因成功连入EGFP基因上游,二者读码框一致无移位,与NP基因在克隆载体中的序列比对,无PCR扩增导致的碱基突变,并且NP基因末端的终止密码子TAA被去除。并添加了kozak序列,为高效表达提供了基因水平的改造。 3.荧光显微镜下观察,NP-EGFP融合蛋白在BHK21细胞中得到高效表达,细胞浆内充满了致密的绿色荧光,荧光呈核周分布,达到了以绿色荧光蛋白作