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目的：肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor，TNF）功能的发挥依赖其膜受体（Tumor necrosis factor receptor TNFR）。体内外实验已证实mTNFR（Membrane-bound tumor necrosis factor receptor mTNFR）介导TNF的程序化死亡作用（apoptosis）、病毒感染肝细胞的清除作用以及其对肿瘤细胞的杀伤作用，是机体杀灭清除肿瘤细胞重要的靶位点，在TNFR表达阴性的大肠癌细胞株经转染TNFR基因后其细胞膜高度表达TNFR，而这种转染细胞可被重组TNF杀伤。体内有多种免疫活性因子（如干扰素、白介素等）即通过激活上调TNFR以达到清除肿瘤细胞的目的，这也是肿瘤免疫治疗、生物治疗的基础，因而诱导并稳定肿瘤细胞膜TNFR对机体抗肿瘤作用致关重要。可溶性肿瘤坏死因子受体（Soluble tumor necrosis factor receptor，sTNFR）来源于相应TNFR的膜外段，可结合TNF，并以此阻止TNF与细胞膜表面的TNFR结合。因此，在体内具有重要的免疫抑制作用。sTNFR已被作为免疫抑制剂应用于临床如器官移植后的急性排斥反应、关节炎等自身免疫性疾病的治疗。而对肿瘤治疗，则需克服免疫抑制。已有研究证实大肠癌患者体液中存在着高水平的sTNFR，其浓度与患者病情、病程及其复发、转移呈正相关系。我们的研究显示大肠癌患者血清高水平的sTNFR主要来源于肿瘤细胞膜TNFR的脱落释放。一方面，肿瘤细胞失去了机体免疫系统作用的靶位点；另一方面，大量的sTNFR释放入血，对机体具有强烈的免疫抑制作用，从而加速了患者恶液质状态的形成，这是肿瘤细胞针对机体主动分泌可溶性受体分子以抵抗机体对肿瘤的杀伤作用，实现肿瘤细胞免疫逃逸的重要方式。目前肿瘤细胞释放sTNFR的确切机理还不明了，可能和某种活性基质金属蛋白酶（MMPs）的酶解有关，故而通过抑制酶活性以减少sTNFR的产生，可能成为肿瘤治疗的新手段，而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）是基质金属蛋白酶主要的生理抑制剂，对活性MMPs具有相对专一的抑制作用，在侵袭性肿瘤组织中MMPs的高表达程度总要高于TIMPs，正由于这种平衡被打破，导致了肿瘤的侵袭和转移。本研究初步探讨MMP-9对大肠癌细胞株释放sTNFR1的促进作用及促进大肠癌转移的可能机制。方法：我们选择大肠癌细胞株Lovo、SW620、SW480、SW1116，研究细胞膜表面TNFR1的表达，同时以SW1116细胞为靶细胞，观察其经MMP-9作用前后TNFR1表达量的变化及细胞培养上清中sTNFR1的改变。一、大肠癌细胞株爬片的制备及免疫荧光染色：将培养的大肠癌细胞株SW1116，SW620，SW480，LOVO细胞调成5×104／mL的细胞悬液，接种于24孔板中，每孔预先置入6mm×6mm盖玻片一张，待细胞生长状态良好时终止培养。4％多聚甲醛固定爬片后进行免疫荧光染色。二、大肠癌细胞株细胞膜表面TNFR1的表达的观察：将以上制备好的细胞爬片在荧光显微镜下观察，TNFR1阳性表达细胞在荧光显微镜下发出绿色荧光。选取SW1116细胞在激光共聚焦显微镜下观察照像。三、MMP-9对大肠癌细胞株表面TNFR1表达的影响：人SW1116大肠癌细胞以2×105／mL接种于24孔板，在37℃、5％CO2培养箱中培养12h使细胞吸附在培养板上换用无血清培养基继续培养24h后加入含有活化后MMP-9的RPMI-1640培养基（无血清）进行干预，总体积为500μL。分组如下①MMP9 0ng／mL：②MMP9154ng／mL；③MMP9 385ng／mL；④MMP9 770ng／mL；⑤MMP9 1155ng／mL，干预3h；或用MMP9 770ng／mL干预0、1.5、3、6和9h。将以上干预前、后的细胞进行流式细胞仪检测细胞表面TNFR1的表达情况，并将细胞培养上清用EP管分装，-20℃冰箱冻存，以各第二部实验使用。四、细胞培养上清中sTNFR1的表达：将第一部分MMP-9干预前后冻存的细胞培养上清室温冻融，500×g离心5min后，用人sTNF-RI定量EIA试剂盒检测上清中sTNF-RI含量。五、统计方法：实验数据以（?）±S表示，采用SPSS10.0统计软件中的one-wayANOVA和LSD及线性相关分析进行统计学分析结果一、大肠癌各细胞株表面表达TNFR1：荧光显微镜下观察显示FITC标记的四株大肠癌细胞株表面均表达TNFR1；在激光共聚焦显微镜下可更清楚地观察到，FITC标记的SW1116大肠癌细胞株表面表达TNFR1。二、当时间固定为3h，不同浓度MMP-9对SW1116细胞TNFR1表达的影响：流式细胞检测结果显示TNFR1的表达，在不同的浓度MMP-9作用3h后，MMP-90ng／mL组（表达率90.92％）；MMP-9 154ng／mL组（表达率85.05％），MMP-9385ng／mL组（表达率87.54％），MMP-9 770ng／mL组（表达率69.96％），MMP-91155ng／mL组（表达率65.06％）。表明MMP-9对SW1116细胞表面TNFR1表达有下调作用且与剂量有一定的关系。三、MMP-9作用不同时间后对TNFR1表达的影响：在固定MMP-9 770ng／mL浓度，不同作用时间条件下，0h组（表达率86.36％），1.5h（表达率83.88％），3h（表达率67.68％），6h（表达率18.08％），9h（表达率14.38％）。表明MMP-9对SW1116细胞表面TNFR1表达的下调作用与时间有一定的关系。四、当时间固定为3h，不同浓度的MMP-9作用后，SW1116细胞培养上清中sTNFR1表达量的变化：ELISA定量检测结果显示，MMP-9 0ng／mL组，sTNFR1的量为28.70pg／mL；MMP-9 154ng／mL组，sTNFR1的量为33.67 pg／mL；MMP-9385ng／mL组，sTNFR1的量为28.66 pg／mL；MMP-9 770ng／mL组，sTNFR1的量为130.23 pg／mL；MMP-9 1155ng／mL组，sTNFR1的量为137.09pg／mL。表明MMP-9促进SW1116细胞表面TNFR1脱落形成sTNFR1且与剂量有一定的关系。五、当MMP-9浓度固定为770ng／mL，MMP-9作用不同时间后细胞培养上清中sTNFR1量的变化：ELISA定量检测结果显示，0h组sTNFR1的量为28.69pg／mL；1.5h组sTNFR1的量为49.34pg／mL；3h组sTNFR1的量为130.23pg／mL；6h组sTNFR1的量为176.36pg／mL；9h组sTNFR1的量为189.36pg／mL。表明MMP-9促进SW1116细胞表面TNFR1脱落形成sTNFR1且与时间有一定的关系。六、MMP-9作用前后SW1116细胞TNFR1的表达与细胞培养上清中sTNFR1的关系：经线性相关分析显示两者呈明显负相关结论一、大肠癌细胞株表达TNFR1二、MMP-9促进SW1116细胞表面TNFR1脱落形成sTNFR1，但有剂量和时间依赖性。MMP-9下调大肠癌细胞表面TNFR1的表达，可能与大肠癌侵袭转移密切相关。