【摘 要】
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目的：将GPA基因pre-mRNA和mRNA进行靶点筛选，并分析各靶点干预基因表达的效果，通过比较pre-mRNA和mRNA靶点的基因干预效果，为反义技术设计提供指导和方法。方法：从人K562细胞获得包含内含子和外显子的GPA基因，并通过mRNA反转录得到cDNA基因，获得GPA-DNA和GPA-cDNA阳性克隆。体外转录获得pre-mRNA和mRNA，采用MAST的方法筛选GPA-pre-mRN
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目的：将GPA基因pre-mRNA和mRNA进行靶点筛选，并分析各靶点干预基因表达的效果，通过比较pre-mRNA和mRNA靶点的基因干预效果，为反义技术设计提供指导和方法。方法：从人K562细胞获得包含内含子和外显子的GPA基因，并通过mRNA反转录得到cDNA基因，获得GPA-DNA和GPA-cDNA阳性克隆。体外转录获得pre-mRNA和mRNA，采用MAST的方法筛选GPA-pre-mRNA和GPA-mRNA的靶点，通过反义核酸进行靶点体外有效性的验证。根据体外验证结果较好的靶点设计特异性的Ribozyme序列并构建慢病毒载体质粒，进行慢病毒的包装后，转染K562细胞。对转染各靶点Ribozyme的细胞，从mRNA水平分析GPA基因表达，评价其干预效果。结果：成功构建GPA-DNA和GPA-cDNA阳性克隆并体外转录得到pre-mRNA和mRNA；采用MAST的方法从GPA基因中成功筛选得到9个可能靶点，靶点有效性体外验证确认3个有效，设计4个干预靶位置；对这四个靶点序列设计Ribozyme，成功构建了包装Ribozyme表达载体的慢病毒，并转染K562细胞；定量PCR的结果表明KD2、KD3和KD4三组mRNA的表达水平显著下降（P＜0.05）；KD4各组基因敲减效率均在70%以上，为最佳靶点。结论：获得GPA全长基因4个有效靶点，经Ribozyme技术分析发现位于内含子上的1号和3号靶点干预效果不如位于外显子上的2、4号靶点基因下调作用效果好，其中4号干预效果最好。实验显示，基于pre-mRNA获得的反义靶点并未显示较好下调作用，可能对基因干预无显著意义，而mRNA的靶点干预仍然是值得重视和关注的焦点。
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