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目的:小分子化合物N2E(N-(2-乙氧基苯基)-N’-羟基辛二酰胺)是SAHA的同源异羟肟酸衍生物,对HDAC的抑制作用较SAHA强。本实验将应用于治疗肝纤维化的相关研究,评价N2E的治疗肝纤维化作用效果,阐明其可能的作用机制,为今后的药物研究打下一定的实验和理论基础。方法:1.N2E抗动物肝纤维化模型实验:C57小鼠70只,随机均分7组,即阴性对照组、肝纤维化模型组、N2E三个剂量治疗组(10mg/kg、20 mg/kg、40mg/kg)、阳性药物对照组SAHA(40mg/kg)以及阳性药物对照组水飞蓟宾(40mg/kg)。除阴性对照组外,其它组小鼠腹腔注射20%CCl4,每周2次,持续6周,同时治疗组隔天同体积灌胃给药,直至6周实验结束停止给药。实验结束后24h,收集血样,检测其血清ALT、AST的活力;收集肝脏标本,检测肝组织的羟脯氨酸水平以及通过组织病理观察、天狼星红染色观察肝纤维化的情况;通过免疫组化检测肝纤维化进程。2.流式细胞仪检测N2E对细胞周期和凋亡的影响;Annexin V-FITC/PI双染法检测N2E诱导LX-2细胞凋亡的作用;再通过线粒体膜电位检测以及Caspase-3活性试剂盒检测N2E对LX-2细胞凋亡作用。3.利用免疫组化染色方法在肝纤维化临床样本中,验证HDAC3基因的蛋白水平,并进一步分析HDAC3表达水平与肝纤维化的相关性;通过LX-2的总RNA提取和荧光定量PCR验证N2E作用后的mRNA表达水平。4.Western blotting检测N2E对LX-2细胞肝纤维化相关蛋白的表达影响;使用PDGF-BB对LX-2刺激激活后,免疫印迹法检测其对HDAC3、以及TGF-β1信号通路相关蛋白表达的影响。结果:1.HE染色和天狼星红染色均显示了N2E显著减弱CCl4引起的慢性肝纤维化,与模型组比较,N2E组纤维化程度有了明显的下降趋势(p<0.001),N2E修复程度强于阳性药物SAHA组以及水飞蓟宾组;相较于模型组,N2E能明显降低肝纤维化小鼠血清ALT和AST水平以及组织羟脯氨酸的含量,差异具有统计学意义(p<0.01),胶原纤维含量接近正常水平;IHC检测肝星状细胞活化标志物α-SMA的表达情况,N2E组较模型组有明显下调。2.细胞周期分析实验显示,N2E对LX-2细胞的细胞周期影响是通过阻滞于S期,而发挥抑制细胞增殖作用,且呈现浓度依赖性作用。与阳性药物SAHA结果一致;凋亡检测实验结果显示,N2E(2.5μM、5.0μM及10.0μM)及10μM SAHA均能显著诱导LX-2细胞的凋亡发生(p<0.05),且呈现浓度依赖性。高浓度(10μmol/L)的N2E能明显下调线粒体膜电位,差异具有统计学意义(p<0.01)。N2E能明显提升LX-2中Caspase-3的活性,且强于阳性药SAHA。3.对收集的20例肝病组织标本进行HDAC3的免疫组化染色检测,与正常肝对照组织比较,肝纤维化组织中HDAC3的表达升高显著。荧光定量PCR检测技术显示,通过特异性抑制HDAC3,TGF-β1表现出明显的下调趋势(p<0.05),同时,肝星状细胞活化标志物α-SMA以及胶原纤维Collagen-α1也呈现出明显的表达下调。4.免疫蛋白印记结果显示,与Control组相比,N2E组下调了HDAC3、α-SMA、TGF-β1以及促进Cleaved-Caspase-3蛋白的表达水平;在用PDGF-BB刺激LX-2细胞进行激活后,使用RGFP966特异性抑制HDAC3对TGF-β1以及α-SMA具有下调作用,而N2E对TGF-β1和α-SMA表达下调作用不明显,SAHA结果类似。结果表明,异羟肟酸类HDAC抑制剂对PDGF-BB体外肝纤维化模型没有明显作用。同时,根据HDAC3特异性抑制剂RGFP966的作用结果提示,N2E可能通过抑制HDAC3来下调TGF-β1,进而抑制LX-2细胞的增殖和细胞外基质的积累。结论:本文通过体内外的实验,首次揭示了N2E对四氯化碳诱导肝纤维化模型具有抗肝纤维化作用和保护肝脏功能的作用;阻滞肝星状细胞周期于S期和诱导其凋亡作用。其作用机制可能通过抑制HDAC3,影响TGF-β1信号通路来发挥其抗肝纤维化的作用。