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牛乳铁蛋白肽是富含Trp的小分子抗菌肽。它具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗真菌等活性;同时具有促生长和免疫调节作用;口服牛乳铁蛋白肽能够与肠道黏膜上皮细胞及淋巴细胞作用刺激黏膜免疫,增加免疫球蛋白的产生,还能刺激机体内部各种细胞因子的变化。本实验室已构建了表达牛乳铁蛋白肽(Lfcin和LFampin)的重组乳酸乳球菌p AMJ399-LFBA/MG1363,前期实验表明其具有一定的抗菌活性,为进一步检测其在生产中的应用,我们做了以下研究:以牛乳铁蛋白为免疫原,通过腹腔注射致敏BALB/c小鼠,经细胞融合、阳性孔克隆及亚克隆,筛选出3株牛乳铁蛋白单克隆抗体1C5、2E10和4E10,检测抗体亚型分别为Ig M、Ig M、Ig G1,效价测定结果分别为1:103、1:103、1:104。三株抗体分别与牛乳铁蛋白肽的合成肽Lfcin和LFampin进行ELISA检测,结果显示杂交瘤细胞株4E10细胞上清可与Lfcin发生特异性反应,可见,牛乳铁蛋白单克隆抗体4E10识别的抗原表位在牛乳铁蛋白肽Lfcin上。取能够分泌牛乳铁蛋白抗体的杂交瘤细胞株4E10的细胞上清与实验室构建的重组乳酸乳球菌pAMJ399-LFBA/MG1363经Western blot检测目的蛋白的表达,结果可见重组菌在表达目的蛋白的位置出现与预期结果相一致的约4.3KD的反应带,由此说明牛乳铁蛋白肽在重组乳酸乳球菌中获得表达。为检测表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌对雏鸡生长的影响,将1日龄雏鸡随机分成4组,每组8只,实验组饲喂p AMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌,以饲喂p AMJ399/MG1363空载体组、GM17培养基组和抗生素组作为对照,连续饮水饲喂14d,测定雏鸡体重变化及饲料重量;心脏采血处死雏鸡测定免疫器官胸腺、脾和法氏囊的指数;同时收集回肠和盲肠的肠黏液,用菌落计数的方法比较各组肠道菌群差异。结果表明饲喂p AMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌组与培养基和空载体对照组相比,雏鸡的日增重显著增加,料重比显著降低,提高了饲料的转化率。饮水中添加p AMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比,胸腺指数、脾指数和法氏囊指数均有所增加且差异极显著(P<0.01)。回肠和盲肠肠道菌群测定结果可见,p AMJ399-LFBA/MG1363组降低了大肠杆菌、链球菌的数量,提高了乳酸杆菌和双歧杆菌的含量。以上结果表明,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够促进雏鸡生长,改善肠道菌群和提高机体免疫。为进一步检测重组乳酸乳球菌的抗菌活性,本实验对其抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用进行研究。将1日龄雏鸡随机分成4组,每组15只,实验组饲喂p AMJ399-LFBA/MG1363重组乳酸乳球菌,以饲喂p AMJ399/MG1363空载体组、GM17培养基组和抗生素组作为对照,连续饲喂14d,第7d时给雏鸡灌服鸡白痢沙门氏菌1m L(3.16×1012cfu/mL),连续观察7天,并记录临床症状和发病情况;分别于攻菌前0h和攻菌后的1d、3d、5d和7d心脏采血处死雏鸡,采集血清及盲肠黏液,通过试剂盒检测血清中总Ig G和盲肠黏液中总SIg A的水平;取雏鸡盲肠扁桃体,研磨后提取RNA,q RT-PCR测定非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平;攻菌后的第7d采集各组雏鸡的心脏、肝脏、脾脏及十二指肠,HE染色观察各组织器官病变情况。结果表明饮水中添加p AMJ399-LFBA/MG1363能提高血清总Ig G和黏液中总SIg A免疫球蛋白水平,增强其免疫力;其中攻菌后5d和7d雏鸡血清中Ig G的含量显著升高,与培养基组相比差异极显著(P<0.01),攻菌7d后雏鸡黏液中SIg A的含量高于培养基组,且差异极显著(P<0.01),与抗生素组无明显差异。对各组织器官进行HE染色后,p AMJ399-LFBA/MG1363组和抗生素组心脏、肝脏、脾脏及十二指肠病变情况明显轻于培养基组和空载体组。对非特异免疫信号通路的TLR4、MyD88、NF-κB、TNF-α、IL-8、IL-6的转录水平测定结果表明,p AMJ399-LFBA/MG1363组雏鸡感染3d时,TLR4、MyD88 mRNA相对水平显著升高;7d时有所下降,其中p AMJ399-LFBA/MG1363组TLR4 mRNA相对水平高于培养基组,差异极显著(P<0.01),MyD88 mRNA相对水平高于培养基组,差异显著(P<0.05);感染7d时,pAMJ399-LFBA/MG1363组与培养基组相比,TNF-α、NF-κB、IL-8 mRNA相对水平高,TNF-αmRNA转录水平差异极显著(P<0.01),NF-κB、IL-8 mRNA相对水平差异性显著(P<0.05),IL-6 m RNA相对水平差异不显著(P>0.05);本研究表明,雏鸡感染鸡白痢沙门氏菌后,表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌能够缓解各器官病变,提高血清和黏液中免疫球蛋白水平,激活先天免疫系统及信号通路,在抗鸡白痢沙门氏菌感染的过程中起到了保护作用。以上结果表明表达牛乳铁蛋白肽的重组乳酸乳球菌作为抗生素的替代品应用于饲料添加剂中具有潜在的应用前景,能够起到促进雏鸡生长、抗鸡白痢沙门氏菌感染的保护作用。