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研究背景肝癌是一种肝脏的恶性肿瘤,在我国发病率和致死率都居前五名,其治疗方法以小分子化学药物为主,但是小分子药物易产生耐药性,严重限制其治疗效果。抗肿瘤多肽因具有低毒性、多样性、低免疫原性和不易产生耐药性等优点,受到越来越广泛的关注。多肽来源广泛,天然抗肿瘤肽含量丰富,已被大量用于基础研究和临床试验,但是天然来源的多肽稳定性不高,可修饰性不强,一定程度上限制了其应用。人工设计和合成的多肽具有灵活的可修饰性,因此具有更好的应用前景。大量研究发现,抗癌肽发挥其生物活性的机制有破坏细胞膜结构,诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞迁移和侵袭,调控血管生成等,大部分多肽的作用机制并不是单一的,而是结合了多种作用方式来抑制肿瘤的生长和恶化。虽然抗肿瘤多肽具有很明显的优势,但是在肿瘤细胞靶向能力上还存在不足,所以将抗肿瘤多肽与基因靶向治疗法结合将是一个很有潜力的研究方向。人端粒酶（Human telomerase reverse transcriptase,hTERT）启动子在肿瘤细胞中活性可接近巨细胞病毒（Cytomegalovirus,CMV）启动子,而在正常细胞中活性很低或处于失活状态,这为该启动子用于肿瘤的靶向性治疗提供了理论基础。实验目的本实验通过模拟抗肿瘤肽结构特点设计合成生物肽,并评估其理化性质、结构特点和生物活性。为提高多肽的肿瘤特异性,将多肽基因插入含hTERT启动子的质粒中,构建重组质粒,并在体外探究该重组质粒的肿瘤细胞靶向性以及对肝癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭、细胞膜结构的影响。实验方法利用计算机软件Discovery studio结合多条抗菌肽活性片段并模拟抗肿瘤肽的结构特点设计多肽KK-64,并用生物信息学工具预测多肽相对分子质量、亲疏水性、二级结构、稳定性等性质。化学合成KK-64多肽,通过细胞活性检测实验探究该多肽对肝癌细胞HepG2和正常肝细胞HL-7702活性的影响,并通过乳酸脱氢酶（Lactic dehydrogenase,LDH）检测实验探讨多肽对细胞的杀伤能力。将KK-64多肽以人源偏好密码子反翻译成DNA序列,并通过分子克隆方法将kk-64序列插入到含hTERT启动子的载体pcTERT（该载体为本实验室前期构建）中,用限制性内切酶切的方法和基因测序法鉴定重组质粒pcTERT-kk-64。用脂质体将重组质粒pcTERT-kk-64转染到HepG2和HL-7702细胞中,用细胞活性检测试剂盒检测细胞增殖能力,并通过Annexin V/PI双染法结合流式细胞术检测细胞凋亡率,同时用western blot法分析内源性线粒体凋亡途径和外源性死亡受体途径相关凋亡蛋白的表达和活化情况。在HepG2细胞中转染pcTERT-kk-64重组质粒和对照组质粒pcTERT后,用Transwell小室检测细胞迁移能力,在Transwell小室铺上Matrigel基质胶后,再观察细胞侵袭能力的变化,进一步通过Real-time PCR法检测与细胞迁移和侵袭能力相关的基因MMP-2和MMP-9的转录表达水平变化。利用细胞膜染料Dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate（DIO）对转染了pcTERT和pcTERT-kk-64质粒的HepG2和HL-7702细胞进行染色,然后在激光共聚焦显微镜下观察细胞膜形态变化。实验结果经生物信息学工具分析,KK-64多肽性质稳定,具有两极性,是一条以α-螺旋结构为主的阳离子多肽。经检测,KK-64多肽能明显抑制HepG2和HL-7702细胞的增殖能力,IC50值分别为3.256μM和3.603μM。通过LDH实验证实,KK-64多肽可在很短时间内裂解细胞膜。因为对肝癌细胞和正常肝细胞都有很强毒性,本实验将kk-64序列插入到pcTERT载体中,经酶切和测序鉴定,kk-64序列成功插入pcTERT载体,得到pcTERT-kk-64重组质粒。将pcTERT-kk-64重组质粒转染到HepG2和HL-7702细胞中,从细胞活性检测结果可知重组质粒可明显抑制HepG2细胞活性,而对HL-7702细胞没有明显影响。凋亡检测结果也显示重组质粒可诱导HepG2细胞发生凋亡,并激活线粒体凋亡途径和死亡受体凋亡途径,但是并不引起HL-7702细胞的凋亡。从重组质粒抑制了HepG2细胞的迁移和侵袭能力可知,重组质粒能抑制肝癌细胞的转移生长。最后,细胞膜染色实验证实kk-64基因能在HepG2细胞中表达并破坏细胞膜结构,而对HL-7702细胞膜形态没有明显影响。结论及意义综上所述,KK-64多肽在肝癌细胞中具有很好的生物学活性,重组质粒pcTERT-kk-64不仅能抑制肝癌细胞增殖,诱导凋亡,抑制迁移和侵袭,破坏其细胞膜结构,还具有肿瘤细胞靶向性。本研究的完成为抗肿瘤肽的靶向性研究提供了新的思路,并为新型肝癌治疗药物的开发提供了新的方向和研究基础。