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菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.),是我国十大名花和世界四大切花之一。氮素作为植物生长必需的大量元素,是构成氨基酸、核酸和蛋白质等生物大分子的重要组成部分,在植物生长和发育过程发挥着重大作用。为提高菊花产量和品质,大量氮肥被施用于土地。然而,过量的氮肥使用及较低的氮肥利用率不仅严重降低了菊花的产量和品质,而且导致了土壤次生盐渍化和水体的富营养化。为减少氮肥施用和提高植物氮肥利用率,深入研究菊花吸收利用氮素的生理与分子机制意义重大。本试验依据实验室之前克隆得到的菊花CmNRT2s基因家族中的基因序列克隆得到了CmNRT2.5b和CmNRT2.7b基因及CmNRT2s启动子,并通过构建表达载体获得转基因拟南芥和烟草株系来综合研究CmNRT2.5b和CmNRT2.7b的功能。同时也对转录因子CmLBD38进行了克隆与功能分析。主要研究结果如下:1.菊花CmNRT2s基因启动子克隆和功能元件分析NRT2s基因家族在硝酸盐吸收转运过程中发挥着重要功能。通过染色体步移方法从菊花基因组中分离克隆获得了 CmNRT2.2、CmNRT2.3、CmNRT2.5、CmNRT2.6和CmNRT2.7 的启动子序列,长度分别为 1597bp、1231bp、949bp、2206bp 和 1567bp。通过Softberry数据库和PLACE数据库对启动子序列进行分析发现多个与硝态氮响应、碳代谢和光调控相关的功能元件,有助于进一步了解CmNRT2s的表达特性和挖掘响应硝态氮的顺式作用元件。2-菊花CmNRT2.5b和CmNRT2.7b基因克隆及功能研究利用RT-PCR技术克隆了切花菊’南农雪峰’高亲和硝酸盐转运蛋白基因CmNRT2.5 和 CmNRT2.7 的 cDNA 片段,命名为 CmNRT2.5b 和 CmNRT2.7b。将克隆得到的氨基酸序列与实验室之前得到的序列比对发现,二者相似性为98.41%和99.34%.构建表达载体pMDC43-CmNRT2.5b和pMDC43-CmNRT2.7b转化拟南芥后各得到转基因株系3个和5个。同时将克隆得到的菊花CmNRT2.和CmNRT2.7b启动子构建到含GUS蛋白基因的pORER2载体上,瞬时转化烟草后将叶片组培筛选培养后获得烟草稳定遗传植株。这些转基因材料的获得为深入探讨研究基因及启动子的功能奠定了基础。3.菊花CmLBD38基因克隆和功能分析本研究通过转录组数据库的EST序列信息、RT-PCR和RACE方法克隆出切花菊品种’南农雪峰’ LBD家族基因的cDNA全长序列,命名为CmLBD38。序列分析表明:CmLBD38全长845bp,其中开放阅读框(ORF)长为525bp,编码175个氨基酸;存在一个由107个氨基酸组成的LOB家族结构域,属于LBD基因家族;系统进化树分析发现,CmLBD38与拟南芥LBⅡ类转录因子亲缘关系较近.构建绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)融合表达载体 pMDC43-CmLBD38、酵母表达载体pGBKT7-CmLBD38 和 35S::GAL4-DB-CmLBD8 以对 CmLBD38 蛋白的亚细胞定位和转录活性进行分析,结果发现CmLBD38基因定位于细胞核,但没有转录激活活性和转录抑制活性。同时通过异源转化拟南芥获得3个转基因株系.