研究背景:环境污染对人类健康的影响一直是全球所关注的重要公共卫生问题。研究发现,人类80%以上肺癌发生与生活和工作环境中接触的化学致癌物密切相关。遗传学和表观遗传学在化学致癌物诱导肺癌发生的过程中发挥至关重要的作用。课题组前期研究证实DNA甲基转移酶1/3a调控DNA高甲基化导致基因沉默是环境致癌物3-甲基胆蒽(3-methylcholanthrene,3-MCA)诱导肺癌发生发展过程中的关键分子事件,但具体作用机制还不明确。研究发现TET家族基因可通过多种途径作用修饰5-甲基胞嘧啶并参与DNA去甲基化过程,在正常生理及疾病发生过程中发挥重要作用。通过查阅文献并结合课题组前期研究,我们推测TET1可能通过调控DNA甲基化/去甲基化动态平衡参与化学物致肺癌发生全过程,但相关作用机制尚待深入研究。通过文献检索,暂未见该基因在环境化学物诱导肺癌发生过程中的表观调控及作用机制的相关报道。因此,本研究从体内和体外等多方面进行实验设计,系统研究TET1及下游关键通路介导的表观调控和化学致肺癌之间的关系,探讨其作用机制,将为从表观遗传学角度寻找化学致癌的早期标志物和预防策略提供新的线索。研究目的:1.探索环境致癌物3-MCA诱导肺癌发生过程中的分子变化及调控途径,筛选表观遗传调控的应答分子。2.探究TET1基因在肺癌发生过程中的表达变化趋势。3.初步明确TET1基因在肺癌发生发展过程中发挥的功能及其作用机制。材料方法:1.采用环境致癌物3-MCA对人支气管上皮细胞HBE进行长期低剂量(10μM)染毒,诱导HBE细胞恶性转化。通过细胞增殖、克隆形成、软琼脂集落形成及裸鼠成瘤等实验对细胞进行恶性程度检测,对恶性转化细胞进行全基因组表达谱分析及羟甲基化测序分析,以筛选候选应答分子。2.采用q RT-PCR和Western blot方法分析3-MCA诱导的HBE细胞恶性转化过程中和3-MCA染毒大鼠肺组织中TET1基因m RNA及蛋白表达水平;采用免疫组化检测临床肺癌患者肿瘤及癌旁组织中TET1的蛋白表达水平。3.通过构建TET1过表达及敲低TET1基因表达载体建立TET1差异表达细胞模型,采用CCK-8、集落形成实验、划痕愈合实验、Transwell实验等方法,探讨TET1基因对细胞生长、侵袭及迁移能力的影响。4.采用皮下注射稳定转染的TET1过表达细胞建立裸鼠成瘤模型,观察TET1过表达对动物体内细胞生长的影响;采用TUNEL及Ki67免疫组化检测瘤体组织中细胞凋亡和增殖情况,初步探索TET1基因影响体内细胞生长的机制。5.采用q RT-PCR和Western blot检测肺癌细胞中TET1基因下游关键通路及分子的表达,结合抑制剂处理及甲基化/羟甲基化分析,初步探索TET1基因在3-MCA诱导肺癌发生过程中调控下游通路的机制。研究结果:1.构建了3-MCA诱导的人支气管上皮细胞HBE恶性转化细胞模型,并在此基础上建立了恶转细胞模型的基因表达图谱及羟甲基化图谱。(1)研究发现,3-MCA诱导的第45代(P45)HBE恶性转化细胞的细胞生长速度较对照组明显加快。软琼脂集落形成实验、平板克隆形成实验检测发现3-MCA诱导的P45 HBE恶性转化细胞的克隆形成数量显著高于对照组。裸鼠成瘤实验中,3-MCA组的裸鼠长出了明显的肿瘤。(2)通过表达谱测序分析发现,在3-MCA诱导的HBE恶性转化细胞中,筛选出707个表达上调基因和686个表达下调的基因。QRT-PCR验证结果与测序一致。GO功能富集分析发现,这些差异表达基因参与了身体发育、动物器官发育、细胞膜、细胞基质的组成,同时参与了炎症复合物等生命活动过程。通过KEGG信号通路分析发现,差异表达的基因主要涉及细胞因子-细胞因子受体相互作用通路、IL-17信号通路、TGF-β信号通路、NOD信号通路,同时参与了造血系统及脂质代谢等过程。(3)通过羟甲基化测序筛选出6696个显著高羟甲基化区域和8425个显著低羟甲基化区域。GO功能富集分析发现,这些差异羟甲基化相关的基因参与了蛋白质分解代谢过程、蛋白质去泛素化过程、内体及多囊体形成等生命过程。KEGG信号通路分析发现,差异羟甲基化相关的基因主要涉及碱基切除修复、蛋白质的消化吸收、肌萎缩性侧索硬化等信号通路。2.TET1基因的表达水平在3-MCA诱导的HBE恶性转化细胞模型和致癌动物模型以及临床肺癌患者肿瘤组织中均显著下调。(1)在3-MCA诱导的HBE恶性转化细胞模型中,TET1基因的m RNA和蛋白表达水平随着3-MCA处理时间增加而显著下调(P<0.01)。(2)在大鼠致肺癌染毒模型中,与正常肺组织相比,3-MCA诱导的癌变组织和肿瘤组织中TET1基因的m RNA和蛋白表达显著下调(P<0.01)。(3)通过对临床肺癌患者肿瘤及癌旁组织TET1的表达分析发现,肺癌患者肿瘤中TET1基因的蛋白表达水平显著下调(P<0.01)。3.TET1基因通过抑制细胞增殖、迁移和侵袭参与肺癌发生发展过程。(1)通过建立TET1过表达细胞模型进行功能分析发现,TET1基因过表达显著抑制肺癌细胞的增殖。干扰TET1基因表达明显促进肺癌细胞的增殖(P<0.01)。(2)过表达TET1基因可以抑制肺癌细胞的侵袭和迁移;在TET1基因稳定转染细胞模型的基础上干扰TET1基因的表达,结果表明敲低TET1表达可以促进肺癌细胞的侵袭和迁移(P<0.01)。提示TET1基因在肺癌发生过程中发挥抑癌作用。(3)裸鼠成瘤实验中,TET1过表达组肿瘤生长速度、肿瘤体积和肿瘤重量明显低于对照组(P<0.01)。TET1过表达组的肿瘤细胞凋亡率明显高于对照组,而Ki67的表达率明显低于对照组(P<0.01),提示TET1基因过表达可导致肺癌细胞在裸鼠体内凋亡并抑制其增殖。4.TET1基因通过调控Wnt/β-catenin信号通路介导肺癌发生过程。(1)过表达TET1基因后,其下游基因CTNNB1和MMP7的m RNA水平和蛋白水平均显著下调;敲低TET1表达水平后,下游CTNNB1和MMP7基因的m RNA水平和蛋白水平均显著上调(P<0.01)。Wnt/β-catenin信号通路抑制剂处理可显著减低TET1在肺癌中的作用(P<0.01)。提示TET1基因可能通过Wnt/β-catenin信号通路抑制肺癌细胞的生长、侵袭和迁移过程。(2)TET1过表达后Wnt/β-catenin信号通路关键基因DACT2和SFRP2的羟甲基化水平显著上升而甲基化水平显著下降,而敲低TET1基因的表达后,这些基因的羟甲基化水平显著下降而甲基化水平显著上升(P<0.01)。提示TET1可能通过羟甲基化修饰调控Wnt/β-catenin通路参与肺癌发生过程。研究结论:1.本研究成功建立了3-MCA诱导的HBE恶性转化细胞模型,表达谱及羟甲基化测序分析筛选出了一系列恶转过程中的关键差异表达基因和差异羟甲基化基因。2.通过GO和KEGG信号通路分析,发现这些差异变化基因可能受到了羟甲基化等多种表观遗传调控,并与多个信号通路相关。3.TET1基因具有抑制肺癌细胞增殖、迁移及侵袭的能力,是一个候选的抑癌基因。4.TET1基因在肺癌发生过程中通过羟甲基化修饰调控Wnt/β-catenin信号通路发挥抑制作用。