论文部分内容阅读
目的脊肌萎缩症(spinal muscular atrophy, SMA)是一种以脊髓前角退行性变为特征的常染色体隐性遗传病,表现为下运动元性、进行性、对称性肌无力和萎缩,近端重于远端,下肢重于上肢。人群中发病率约为1/10000,突变基因携带频率为1/50-1/35。居致死性常染色体隐性遗传病第二位,仅次于囊性纤维变。目前尚没有有效的治疗方法,因此先证者的基因检查和群体中携带者的筛查工作对于遗传咨询、指导生育具有重要的作用。该病的致病基因为运动神经元存活基因SMN(survival mortor neuron gene,SMN),位于5q11.2～13.3。SMN基因有2个拷贝,即SMN1和SMN2。SMN1和SMN2高度同源,二者仅有5个碱基的差别。一般认为SMN1为该病的主要致病基因,SMN2属调节基因,与疾病的严重性呈反比。研究认为,约95%的SMA患者存在SMN1第7和或第8外显子的纯合缺失和SMN1转变为SMN2,而约5%的患者是由基因突变引起的。因此,检测SMN1基因第7、8外显子缺失成为诊断该病的主攻方向。本研究分别采用以往应用最广泛的检测SMN1基因的聚合酶链式限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)方法和最新的多重连接依赖式探针扩增(MLPA)技术对30例临床疑似SMA患儿及其父母进行基因诊断,并对两种方法进行比较,分析两种方法对各类SMN基因缺失先证者诊断的一致性,评估MLPA方法对携带者检出的准确度。方法本研究采用盐析方法提取所有受试者外周血DNA, DNA的纯度和浓度均经核酸定量仪(NADO DROP2000)测定。常规PCR-RFLP方法扩增SMN7、8外显子,用Dral Ⅰ和Ddel Ⅰ酶切PCR产物,2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR及酶切产物,凝胶成像系统记录结果。同时利用MLPA试剂盒P021方法进行验证比较,计算SMN拷贝数,并对病人组、携带者组与正常对照组SMN2拷贝数进行比较,采用SPSS16统计分析。结果根据实验结果共确诊24例为SMA病人,即22例SMN1第7+8号外显子纯合缺失患儿和2例Ex7纯合缺失,两种方法结果一致。回顾分析临床表现,发病年龄,疾病进展等临床资料,确定Ⅰ型9例,Ⅱ型9例,Ⅲ型6例。其余6例PCR-RFLP方法未见异常家系中经MLPA方法分析发现1例患儿和2例母亲为SMN1外显子7、8杂合缺失携带者；MLPA方法还在SMA家系中发现3例“2+0”型携带者。MLPA方法共分析检出52例携带者和18例正常者。结果发现SMN2拷贝数在SMA患者中以4、5为主、携带者以2、3为主、正常人以1、2多见,其各拷贝数的频率分布在病人组与携带者组(x2=30.694)、病人组与正常人组(x2=21.997)中p<0.001,而在携带者与正常人组(x2=3.5)p>0.05。结论与PCR-RFLP相比,MLPA更加简单、准确、高效,仅需要少量的DNA模板就能快速准确的定量SMN1、SMN2,还有助于区分表型和筛查携带者,是一种高效的遗传病基因诊断方法,能为遗传咨询提供可靠的信息,相信以后会在临床广泛应用。