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蛋白质之间相互作用在肿瘤发生发展中起着重要作用,本课题组与西北工业大学自动化学院张绍武教授、陈伟博士团队合作,利用计算机基于蛋白质氨基酸序列自相关函数及PPI-PKSVM模板的方法,预测并验证与p12CDK2-AP1蛋白可能相结合的CD82蛋白,并通过免疫共沉淀Co-IP的方法进行验证。通过体外细胞实验、动物体内移植瘤等实验探讨p12CDK2-AP1蛋白与CD82相结合后对口腔鳞癌细胞OSCC-15的作用机制。目的:1.利用基于蛋白质氨基酸序列自相关函数的计算机方法预测p12CDK2-AP1与其相互作用的蛋白,并使用计算机相关模板PPI-PKSVM进行验证。2.利用Co-IP实验初步验证p12CDK2-AP1与CD82相互作用结果。3.探讨p12CDK2-AP1与CD82相结合后对口腔鳞状细胞OSCC-15生物学行为的影响。4.通过裸鼠移植瘤动物实验探讨p12CDK2-AP1和CD82蛋白相结合后在体内对肿瘤发生、发展的生物学作用。方法:1.使用基于蛋白质氨基酸序列自相关函数的计算机方法和PPI-PKSVM计算机模板技术预测并验证与p12CDK2-AP1蛋白可能相结合的蛋白。2.利用分子克隆技术构建p IRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和p IRES2-EGFP-CD82真核表达质粒。3.将p IRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和p IRES2-EGFP-CD82质粒分别转染至293T及OSCC-15细胞中,培养0,12,24,48,72小时后,Western blot观察表达情况并确定表达效率最高时间。利用免疫共沉淀Co-IP方法,初步验证p12CDK2-AP1与CD82在真核细胞中存在相互作用。4.共同过表达p12CDK2-AP1,CD82基因于OSCC-15细胞,利用MTT实验方法检测其对OSCC-15细胞增殖的影响;利用Transwell小室检测其对OSCC-15细胞侵袭的影响;利用Annexin V-FITC/PI双染细胞凋亡检测对OSCC-15细胞凋亡的影响。5.共同过表达p12CDK2-AP1,CD82基因于OSCC-15细胞后,注射于裸鼠右前肢腋下皮内,以未转染的OSCC-15细胞为空白对照组,OSCC-15细胞/NC（空白质粒）为阴性对照组,注射后7天出现肿瘤,每3天测量肿瘤的最长径和最短径,直至注射后25天。计算肿瘤的体积和各组肿瘤的抑制率。结果:1.使用自相关函数计算技术预测与p12CDK2-AP1相结合的10种蛋白。p12CDK2-AP1和CD82氨基酸序列输入PPI-PKSVM计算机模板,验证p12CDK2-AP1与CD82能够结合。2.成功构建p IRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和p IRES2-EGFP-CD82真核表达质粒。3.过表达p12CDK2-AP1和CD82基因于293T细胞中,并通过Co-IP实验验证了p12CDK2-AP1与CD82存在相互作用。4.分别过表达p12CDK2-AP1,CD82基因及p12CDK2-AP1/CD82基因组于OSCC-15细胞后,p12CDK2-AP1/CD82组相比其他组对OSCC-15细胞增殖和侵袭能力有明显的抑制作用,且明显促进对OSCC-15细胞的凋亡作用。5.裸鼠移植瘤动物实验发现稳定转染p12CDK2-AP1/CD82基因后可明显减小转移瘤大小。结论:本研究首先应用自相关函数计算方法及PPI-PKSVM计算机模板技术预测及验证p12CDK2-AP1的相结合蛋白CD82。成功构建了p IRES2-EGFP-p12CDK2-AP1和p IRES2-EGFP-CD82真核表达质粒。在体外活细胞实验和体内裸鼠移植瘤实验证实,p12CDK2-AP1与CD82相互作用后可以抑制口腔鳞癌细胞OSCC-15细胞的增殖和侵袭,促进OSCC-15细胞的凋亡,并且抑制裸鼠移植瘤的生长。