背景:心血管疾病是影响人类健康的重大公共卫生问题,2016年全球负担疾病报告显示缺血性心脏病己成为我国居民的第二大死因,由其引起的心肌梗死更是导致患者突发死亡的根本原因。尽管临床上常用快速恢复冠脉血流的方法能够使心肌重新获得血液供应,提高心梗患者的存活率,但是这种方式不足以阻止心功能的进一步恶化,并发缺血-再灌注损伤等严重问题。随着“能量饥饿”概念的提出,人们开始意识到能量代谢紊乱是心梗患者发病过程中存在的普遍现象,激发与扶持心肌内源性能量,优化心肌代谢模式,增强心肌细胞抗损伤能力,是缺血心肌保护的新选择。益气活血药(YQHX)是在经典方剂当归补血汤基础上加减而成,被广泛应用于临床气虚血瘀型缺血性心脏病的治疗。前期研究显示益气活血药对心梗大鼠心肌有保护作用,可通过抗炎、改善冠脉微循环障碍、保护线粒体功能等多种途径改善心功能,然而益气活血药对心梗后心肌特别是心肌细胞能量代谢的影响及调控机制尚不明确。因此,本研究以在体大鼠心梗模型和体外缺氧诱导心肌细胞损伤模型为依托,观察益气活血药对心梗后心肌及缺氧心肌细胞的保护作用,并以线粒体功能失调及脂质代谢异常为切入点,探讨基于AMPK/PGC-1α途径益气活血药对心梗后心肌损伤能量代谢的调节作用及机制。第一部分益气活血药对心梗后心肌损伤的作用及机制研究目的:本部分旨在观察PGC-1α在心梗后心肌损伤中的作用,并探讨益气活血药对心梗后心肌损伤的保护作用是否与AMPK/PGC-1α途径相关及其调控机制。方法:研究分为动物和细胞实验。1.动物实验:选取8周龄雄性SD大鼠,通过结扎左冠脉前降支复制大鼠急性心梗模型。将大鼠随机分为4组:①假手术组(Sham);②心梗模型组(MI);③益气活血药组(YQHX);④曲美他嗪组(TMZ),于心梗后7天和28天两个时间点取材、观察相应指标变化。采用超声心动图观察左心功能;采用HE染色观察各组心肌病理学变化;采用透射电镜和荧光酶标法检测心肌线粒体结构和功能;WesternBlot法检测各组心肌组织中PGC-1α活性。2.细胞实验:本实验以H9c2细胞为研究对象,采用心肌细胞缺氧模型,将心肌细胞分为5组:①对照组(Control);②缺血缺氧组(I/H);③低剂量益气活血药组(Y1);④中剂量益气活血药组(Y2);⑤高剂量益气活血药组(Y4)。CCK8法检测细胞活力,筛选出低、中、高三个浓度;采用乳酸脱氢酶试剂盒检测细胞上清LDH变化,采用抗氧化试剂盒和荧光探针检测细胞内MDA、SOD和ROS含量,评估心肌细胞缺氧模型;透射电镜观察心肌细胞线粒体超微结构,JC-1法检测心肌细胞线粒体膜电位变化,评价心肌细胞线粒体结构和功能;RT-PCR和Western Blot法分别检测心肌细胞PGC-1α基因和蛋白表达,筛选出增加PGC-1α活性的最佳剂量。为了进一步探讨益气活血药对缺氧心肌细胞PGC-1α的调控机制,本研究使用AMPK抑制剂Compoundc。实验分为4组:①对照组(Control);②缺血缺氧组(I/H);③中剂量益气活血药组(Y2);④中剂量益气活血药+AMPK抑制剂Compound c组(Y2CC)。Western Blot 法检测心肌细胞 PGC-1α、p-AMPK、NRF-1 及 Tfam 蛋白表达。结果:1.大鼠超声心动图结果7天超声结果,心功能评价:与Sham组相比,MI组心脏左室射血分数(LVEF)、短轴率(LVFS)明显降低。与MI组相比,YQHX组和TMZ组LVEF和LVFS明显增高。心脏结构评价:与Sham组相比,MI组收缩末期和舒张末期内径(LVIDs/d)明显上升。与MI组相比,YQHX组和TMZ组均显著降低LVIDs,但均对LVIDd的影响不显著。28天超声结果,心脏功能评价:与Sham组相比,MI组LVEF、LVFS明显降低。与MI相比,YQHX组LVEF和LVFS明显增高;TMZ组LVEF明显升高,而对LVFS的变化不显著。心脏结构评价:与Sham组相比,MI组LVIDs/d明显上升。与MI组相比,YQHX组和TMZ组均能显著降低LVIDs/d。2.心肌HE染色结果7天HE染色结果,Sham组心肌细胞结构整齐且排列规律;与Sham组相比,MI组梗死边缘区心肌细胞数量减少、结构排列紊乱、大量肌纤维断裂,间质可见大量炎症细胞浸润;YQHX组和TMZ组心肌细胞排列较MI组连续且整齐,间质间可见不同程度的炎症细胞浸润。28天HE染色结果,MI组较Sham组心肌梗死区明显变薄,梗死边缘区可见结构排列紊乱,大量心肌细胞被纤维细胞及胶原组织替代;与MI组相比,YQHX组和TMZ组病变范围明显减少,胶原及纤维细胞所致的心肌纤维化程度改善。3.益气活血药对心肌线粒体结构与功能的影响7天电镜结果,Sham组心肌纤维排列整齐,线粒体排列规律;MI组心肌纤维排列紊乱,线粒体超微结构明显破坏。YQHX组较MI组心肌超微结构损伤明显改善,如线粒体结构较完整,略肿大且呈攒簇现象。28天电镜结果,Sham组心肌纤维排列有序,肌小节完整,线粒体双层膜结构完整。MI组心肌纤维明显断裂、排列紊乱、不规则,可见胶原纤维增生,线粒体嵴模糊、嵴间基质密度加深,甚则出现大量空泡。YQHX组损伤程度明显减轻,排列较规律,线粒体也呈现明显聚集现象。7天和28天ATP结果显示,MI组心肌线粒体ATP含量显著减少(p<0.001),YQHX 组显著增加 ATP 生成(p<0.001)。4.益气活血药对心梗后心肌PGC-1α蛋白表达的影响WesternBlot结果显示:心梗后7天,MI组PGC-lα蛋白表达较Sham组显著降低(P<0.05),而YQHX组显著增强PGC-1α表达(P<0.05),而TMZ组则无统计学差异。心梗后28天,MI组PGC-1α蛋白表达显著下降(P<0.05),YQHX组PGC-1α蛋白表达较MI组明显上升(P<0.05),但TMZ组却未能增加PGC-1α活性。5.益气活血药对缺氧诱导的H9c2心肌细胞的影响CCK8结果显示随着缺氧时间的增加,细胞活力逐渐降低。益气活血药在50-800μg/mL浓度区间内,对正常的H9c2细胞无细胞毒性。与I/H组比较,100μg/mL,200μg/mL和40μg/mL的益气活血药细胞生存率均有显著提高(P<0.05)。为了进一步评估心肌细胞缺氧模型和益气活血药对缺氧心肌细胞的影响,结果显示:在缺氧12h和24h,与Control组相比,I/H组细胞上清LDH释放量明显升高(P<0.001);心肌细胞内SOD水平下降(P<0.01),MDA含量升高(P<0.01),ROS水平明显增加(P<0.05)。与I/H组相比,YQHX组LDH释放量明显降低(P<0.05);SOD活性增加(P<0.05),MDA含量降低(P<0.05),ROS水平下降(P<0.05)。6.益气活血药对线粒体结构和线粒体膜电位的影响电镜结果显示:与Control组相比,I/H组心肌细胞结构发生严重破坏,有很多空泡状结构存在,线粒体出现变圆、肿胀、嵴断裂甚至消失、基质变深。YQHX组在一定程度上改善了缺氧诱导的心肌细胞线粒体结构破坏。线粒体膜电位结果显示:与Control组相比,I/H组线粒体膜电位下降(P<0.001),YQHX组可逆转线粒体去极化现象(P<0.05),尤以200μg/ml浓度效果最佳。7.益气活血药对缺氧诱导的H9c2心肌细胞PGC-1α及相关蛋白表达的影响及调控机制Western Blot结果显示:在缺氧后12h,与Control组相比,I/H组PGC-1α、p-AMPK、NRF-1、Tfam蛋白表达显著降低(P<0.05),YQHX组明显增加缺氧心肌细胞中PGC-1α、p-AMPK、NRF-1等蛋白表达(P<0.05),AMPK抑制剂则逆转益气活血药的上述作用(P<0.05)。将缺氧时间延长至24h,与Control组相比,缺氧24h时I/H组PGC-1α、p-AMPK表达几乎恢复至正常水平,YQHX组均可明显增加缺氧心肌细胞中PGC-1α和p-AMPK蛋白表达(P<0.05),AMPK抑制剂则逆转益气活血药的增强作用(P<0.05)。第二部分益气活血药对心梗后缺血心肌脂质代谢的影响及机制研究目的:本部分采用大鼠心梗模型和心肌细胞缺氧模型,探讨心梗后7天和28天不同时间节点脂质代谢变化及相关机制。方法:研究分为动物和细胞实验。1.动物实验:分组同第一部分。使用全自动生化分析仪检测各组血清中血脂变化;Western Blot法检测各组心肌组织中p-AMPK、PPARα和CPT-1α蛋白变化。2.细胞实验:Western Blot法检测心肌细胞PGC-1 α、PPARα和CPT-1 α蛋白表达情况。结果:1.益气活血药对心梗后大鼠血清中血脂的影响7天血脂结果:与Sham组相比,MI组血清中TC含量明显上升(P<0.05),FFA、TG、LDL-C水平有升高趋势。与MI组相比,YQHX组FFA、TG水平显著降低(P<0.05)。TMZ组则对血清FFA、TC和TG无明显影响。28天血脂结果:与Sham组相比,MI组血清中TG、GLU、LD水平明显上升(P<0.01)。与 MI 组相比,YQHX 组 TG、TC、GLU、LD 含量明显降低(P<0.05);TMZ组则有效降低血清中TG、TC、GLU含量(P<0.05)。2.益气活血药对心梗后心肌p-AMPK、CPT-1α和PPARα蛋白表达的影响Western Blot结果显示:心梗后7天,与Sham组相比,MI组AMPKα磷酸化水平明显增加(P<0.05);CPT-1α和PPARα表达明显减少(P<0.05)。YQHX组显著增加p-AMPK的磷酸化水平和CPT-1α表达(P<0.05),对PPARα有增加趋势但无统计学差异。心梗后28天,与Sham组相比,MI组AMPKα磷酸化水平显著增高(P<0.05),YQHX组进一步显著增加p-AMPK的磷酸化水平(P<0.05)。3.益气活血药对缺氧心肌细胞CPT-1α、PGC-1α和PPARα表达的影响Western Blot结果显示:与Control组相比,I/H组心肌细胞中CPT-1α、PGC-1α和PPARα表达明显下降(P<0.05),而YQHX组明显增加缺氧引起的心肌细胞中CPT-1α PGC-1α和PPARα表达(P<0.05),有趣的是益气活血药上调作用均能够被Compound c阻断,差异显著(P<0.05),这表明益气活血药调节脂质代谢的作用与AMPK磷酸化水平有关。研究结论1.益气活血药可通过保护缺血心肌线粒体结构和功能,调节脂质代谢,抗氧化应激,减轻心肌细胞损伤,从而改善左心室收缩和舒张功能。2.益气活血药可增加缺血心肌p-AMPK、PGC-1α、NRF-1及Tfam等相关线粒体生物合成蛋白的表达,改善线粒体超微结构破坏和线粒体膜电位去极化,增加线粒体ATP的生成,表明益气活血药可保护心肌线粒体结构和功能。3.益气活血药可促进p-AMPK、PGC-1α、CPT-1α及PPARα等脂质代谢相关蛋白的表达,降低血脂含量,表明益气活血药具有调节脂质代谢的作用。4.AMPK抑制剂能抑制益气活血药上调p-AMPK、PGC-1α、NRF-1等相关线粒体生物合成蛋白的水平,提示益气活血药可能通过AMPK/PGC-1α途径的激活保护线粒体结构和功能。5.AMPK抑制剂能抑制益气活血药上调p-AMPK、PGC-1α、CPT-1α及PPARα等脂质代谢相关蛋白的水平,提示益气活血药可能通过AMPK/PGC-1α途径的激活调节调节脂质代谢。综上,本实验研究结果表明AMPK/PGC-1α途径是益气活血药保护线粒体结构和功能,调节脂质代谢的重要途径,在心梗后心肌能量代谢过程中发挥了重要作用。