肝素是一种重要的多糖类抗凝血药物,临床上被广泛用于血栓栓塞、心肌梗塞、血液透析等。目前市场上的肝素主要从猪小肠中提取,但是动物源肝素易受污染,所以需要寻求一种更加安全可靠的肝素制备方法。Heparosan是一类天然酸性多糖,在E.coliK5里以荚膜多糖的形式合成,其与肝素和硫酸乙酰肝素有类似多糖骨架,因此可以通过生物工程技术从heparosan出发制备肝素。本课题以提高E.coliK5生物量和heparosan产量为目的,对培养基和发酵补料方式进行了优化并应用Red同源重组技术敲除了rpoS基因以期减少乙酸的产生。同时为能更便捷的定量E.coli K5发酵产物中的heparosan,在Heparin lyase Ⅲ法的基础上进行了优化使之能直接应用于发酵上清液的检测。通过单因素试验,在葡萄糖合成培养基的基础上对碳源、氮源、磷酸盐和接种量进行优选。对不同的补料方式进行了比较研究,结果表明用氨水调pH的拟指数流加发酵方式的效果最好,E.coli K5生物量和heparosan产量达到5.4 g/L和1.3 g/L,比批次发酵分别提高了138%和 798%。Heparin lyase Ⅲ法是利用Heparin lyase Ⅲ能特异性解聚heparosan的特性定量检测heparosan的酶学方法,但原方法只适用于heparosan粗品。所以在原方法的基础上对检测条件进行了优化,使其能直接检测发酵上清液中的heparosan含量。利用λ-Red重组系统成功敲除了E.coliK5的rpoS基因,通过摇瓶培养比较了野生株和突变株在葡萄糖合成培养基中的生长状况,发现突变株产酸明显减少,但生物量和heparosan产量没有提高。