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水稻矮缩病毒(Rice dwarf virus,RDV)属于持久增殖型病毒,主要由介体黑尾叶蝉传播。在叶蝉内,病毒利用自身编码的非结构蛋白Pns10形成包裹病毒粒体的小管通道,采取"小管运输病毒"的策略进行安全扩散,以抵御叶蝉的各种免疫攻击。这种安全运输病毒策略需要介体蛋白共同参与才能顺利完成,先前研究表明Pns10通过酵母双杂交筛选到介体互作蛋白肌动蛋白(actin)、肌球蛋白(myosin)等,黑尾叶蝉胞质型actin与Pns10的特异性互作决定黑尾叶蝉专化性传播RDV,这些为Pns10互作介体蛋白的筛选提供了基础。鉴于此,本研究继续利用核蛋白互作的Clontech酵母双杂交系统筛选数量相等的成虫和若虫的黑尾叶蝉cDNA库,获取阳性克隆。在NCBI Blastx进行序列比对分析后,预测筛选的基因功能多为与昆虫生长发育、细胞成分等相关,挑选6个可能互作的蛋白:原肌球调节蛋白(tropomodulin,Tmod),线粒体孔蛋白(mitochondrial porin,Mito P),运脂蛋白前体(lipophorin precusor,LP),高密度脂蛋白结合蛋白(Vigilin),凋亡诱导因子(apoptosis inducing factor,AIF),卵黄原蛋白(vitellogenin,Vg),将这6种蛋白的酵母质粒与pGBKT7-Pns10再次回转酵母感受态细胞AH109,确定Pns10与候选蛋白互作。双分子免疫荧光互补技术(BiFC),证明Tmod、Vg和LP与Pns10互作,而Mito P、AIF和vigilin与Pns10不互作。在本氏烟共定位表达系统中,Tmod 和 Vg,vigilin,LP 均能与 RDV Pns10 共定位,而 Mito P、AIF不与Pns10共定位。为进一步明确6个候选蛋白在RDV扩散中发挥的作用,利用RT-qPCR实验检测6个候选蛋白基因在带毒培养细胞和黑尾叶蝉中的相对表达量。结果表明除Mito P与对照组无明显差别外,其余5个基因的相对表达量均高于对照组。由于Tmod作为actin慢生长端的唯一盖帽蛋白,是actin的相关蛋白,而包裹病毒Pns10小管运动是沿着actin纤维丝进行病毒的运输。利用GST-Pull down实验证明Tmod能与RDVPns10在体外发生特异性互作;Tmod荧光抗体免疫标记带毒培养细胞和黑尾叶蝉消化道,Tmod定位在微绒毛上,与Pns10共定位,Pns10小管能够穿出actin形成的微绒毛。RT-qPCR分析Tmod、Pns10、RDVP8在带毒叶蝉中的表达趋势相似。利用dsTmod抑制Tmod在介体中的表达,发现Tmod、Pns10和P8表达量明显下降。并且干扰Tmod表达的第14天,虫体的带毒率也下降了一半。因此,Tmod对Pns10行使功能有正调控作用,Pns10小管依赖于actin的小管动力(ABTM)充分利用Tmod在介体中的调控作用,以至于actin能够无限延伸,反向便捷了Pns10小管插入邻近细胞,甚至为突破介体组织膜屏障提供动力,最终实现病毒扩散。Vg为卵黄蛋白前体,是卵发育的营养物质,在脂肪体上合成释放到血淋巴中,最终被卵巢吸收。利用GST-Pulldown实验进一步确定Pns10与Vg互作。免疫荧光抗体标记培养细胞,发现Vg可与Pns10共定位。此外,Pns10与Vg还可在卵巢滤泡细胞、菌胞和卵巢管柄处共定位,但当Pns10与Vg大量共定位于卵巢管柄时,卵内并未标记到Pns10蛋白,因此推测卵巢管柄是RDV侵入卵的初侵染点,Vg与Pns10互作帮助了病毒在卵内的扩散。