锰(manganese, Mn)作为机体的必需微量元素之一,在体内可参与许多生物化学反应。但是,过量的锰进入体内则会引起锰中毒,出现类似帕金森氏综合征的神经系统病变。人类可以通过职业吸入和环境暴露等途径接触神经毒物——锰。进入体内的锰主要蓄积在大脑的纹状体和苍白球等基底神经节部位。进入脑组织中的锰主要由星形胶质细胞摄取,并存储于其中。目前,对于锰中毒致神经损伤机制的研究多局限于单胺类神经递质。近年来,有学者提出,锰中毒可导致兴奋性递质谷氨酸(glutamate, Glu)释放加剧,对神经细胞产生毒性作用,但其机制尚未被完全阐明。而Glu的清除主要依赖于谷氨酸转运体(glutamate transporters, GluTs)对其重摄取,以终止其突触传递效应。现已经通过克隆技术获得五种不同的GluTs,其中谷氨酸／天冬氨酸转运体(glutamate/aspartate transporter, GLAST)和谷氨酸转运体-1(glutamate transporter-1,GLT-1)主要表达在星形胶质细胞膜上。摄入到胞内的Glu可在谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase, GS)的作用下转变成谷氨酰胺(glutamine, Gln), Gln再回转至神经元,并在磷酸激活的谷氨酰胺酶(phosphate activated glutaminase, PAG)作用下重新生成Glu,形成Glu-Gln循环。故推测Glu的代谢和转运障碍可能会在锰中毒的发生、发展中起着重要的作用。利鲁唑是一种Glu调节剂,具有阻断Na+离子通道的作用,在临床上用于治疗肌萎缩性侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)。已有文献证实利鲁唑具有抑制Glu释放,促进Glu摄取,增强Glu与GluTs结合的作用。但是,目前应用利鲁唑干预锰中毒致Glu代谢和转运障碍的研究,鲜有报道。本研究拟通过体内与体外实验相结合的方法,首先建立动物模型,研究MnCl2致大鼠脑纹状体Glu代谢转运障碍及利鲁唑的防护作用。其次,建立细胞培养模型,研究MnCl2致星形胶质细胞毒性及利鲁唑的防护作用。最后,对星形胶质细胞Glu代谢转运进行研究,探讨MnCl2产生神经毒性作用的机制,及利鲁唑的防护作用,并进一步验证体内实验的结果。材料与方法1、MnCl2致大鼠脑纹状体Glu代谢转运障碍及利鲁唑的防护作用由中国医科大学实验动物中心提供实验用清洁级Wistar大鼠100只,体重180±10克,雌雄各半。按体重随机分成5组,每组20只。第1组为对照组,第2-4组分别为低、中、高剂量染锰组,第5组为利鲁唑干预组。第1-4组均皮下注射生理盐水,第5组皮下注射21.35μmol/kg利鲁唑。2小时后,第1组腹腔注射生理盐水,第2、3组分别腹腔注射8和40μmol/kg MnCl2,第4、5组均腹腔注射200μmol/kg MnCl2,注射容量均为5ml/kg。连续染毒4周,每周5次,隔日干预1次。最后一次干预并染毒24小时后,每组取8只大鼠乙醚麻醉后,处死,取其部分纹状体,使用火焰原子吸收法测定组织中锰的含量。然后,每组取2只大鼠,使用4%多聚甲醛灌流后取纹状体,部分组织用HE染色观察组织病理形态改变,另取部分组织,用2.5%戊二醛固定,应用透射电镜观察其内胶质细胞超微结构的改变。再取各组4只大鼠,分离纹状体后,制备成单细胞悬液,用流式细胞仪(flow cytometry, FCM)检测细胞凋亡的情况。各组再取6只大鼠,使用试剂盒测定组织中Glu和Gln的含量,依据Renis等描述的γ-谷氨酰转移酶的非生理学催化反应测定GS的活力,依据Curi等的方法测定PAG的活力,应用Murali等的方法测定Na+-K+-ATPase的活力。再取上述用于Mn含量测定的4只大鼠剩余纹状体用RT-PCR法检测GS、GLAST及GLT-1 mRNA表达,另外4只大鼠剩余纹状体用于Western blot法检测GS、GLAST及GLT-1蛋白水平。2、MnCl2致星形胶质细胞毒性及利鲁唑的防护作用参照Hertz等的方法进行星形胶质细胞培养,应用胶质原纤维酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein, GFAP)免疫细胞化学反应进行细胞鉴定,阳性率达95%后进行实验。通过MTT法和LDH漏出分析法,观察MnCl2(0～1000μmol/L)处理6-48h后细胞毒性的变化和利鲁唑(25～200μmol/L)预处理1-12h后的干预作用,并选择适宜且有代表性的锰处理和利鲁唑干预的剂量和时间。然后,使用倒置相差显微镜观察细胞形态学改变,应用FCM检测星形胶质细胞凋亡及细胞周期。3. MnCl2致星形胶质细胞Glu代谢转运障碍及利鲁唑的防护作用星形胶质细胞经终浓度为0、125、250和500μmol/L MnCl2处理24h后,并在500μmol/L MnCl2的剂量水平上提前6小时给予100μmol/L利鲁唑干预。参照上述方法检测GS和Na+-K+-ATPase的活力,GS、GLAST及GLT-1 mRNA表达和蛋白水平。4、数据处理和统计分析实验所得数据以平均数±标准差表示,用SPSS 11.5软件单因素方差分析方法(ANOVA)进行组间差异的显著性检验,两组间比较用q检验(Student-Newman-Keuls, SNK)。结果1、MnCl2致大鼠脑纹状体Glu代谢转运障碍及利鲁唑的防护作用与对照组相比,随着锰处理剂量的增加,大鼠纹状体组织内Mn含量逐渐增加,纹状体组织形态及其内胶质细胞的超微结构损伤的程度逐渐加重；纹状体细胞凋亡率逐渐增加；Glu含量逐渐增加,Gln含量逐渐降低；PAG活力逐渐增加,GS和Na+-K+-ATPase的活力逐渐下降；GS、GLAST及GLT-1 mRNA表达和蛋白水平逐渐降低。与200μmol/kg MnCl2组相比,在利鲁唑干预组中,Mn含量降低,纹状体组织形态及其内胶质细胞超微结构损伤的程度缓解；纹状体细胞凋亡率下降；Glu含量降低,Gln含量增高；PAG活力下降,GS和Na+-K+-ATPase的活力上升;GS、GLAST及GLT-1的mRNA表达和蛋白水平增高。2、MnCl2致星形胶质细胞毒性及利鲁唑的防护作用培养的星形胶质细胞,经GFAP免疫细胞化学染色鉴定后,阳性率95%。通过MTT法和LDH漏出分析法观察MnCl2对星形胶质细胞是否具有细胞毒性作用。结果表明,随着锰处理剂量(0～1000μmol/L)和时间(6-48h)的增加,星形胶质细胞的活力逐渐下降,LDH漏出逐渐增加,并呈现出一定的剂量和时间依赖性的效应关系。且在500μmol/L MnCl2的剂量水平上,处理24小时后,细胞活性率达51.81%,大约达到半数抑制浓度(50% inhibitory concentration, IC50)。提前1h、3h、6h和12h给予星形胶质细胞25-200μmol/L利鲁唑干预后。使用MTT法和LDH漏出分析法观察发现,与MnCl2组比较,在100和200μmo1/L利鲁唑干预6h和12h后,星形胶质细胞的活力明显增加,LDH漏出明显下降。但在同一时间水平,在100和200μmol/L利鲁唑两个剂量组之间并未见显著差异,且在同一剂量水平,6h和12h两个时间组之间亦未见显著差异。故在后续的实验中,我们选择0、125、250和500μmol/L MnCl2和24h分别作为锰处理的剂量和时间,100μmol/L利鲁唑和6h分别作为干预剂量和时间。与对照组相比,随着锰处理剂量的增加,星形胶质细胞的形态学损伤程度逐渐加剧；星形胶质细胞凋亡率逐渐增加；G0／G1期细胞指数逐渐升高,S期细胞指数逐渐降低,G2／M期细胞指数未见明显差异。与500μmol/L MnCl2组相比,在利鲁唑提前干预6h组中,星形胶质细胞的形态学损伤明显降低；星形胶质细胞凋亡率显著下降；G0／G1期细胞指数显著下降,S期细胞指数显著增加,G2期细胞指数未见明显改变。3、MnCl2致星形胶质细胞Glu代谢转运障碍及利鲁唑的防护作用0、125、250和500μmol/L MnCl2处理24h后,与对照组相比,随着锰处理剂量的增加,GS和Na+-K+-ATPase的活力逐渐下降,GS、GLAST及GLT-1 mRNA表达和蛋白水平亦逐渐降低。与500μmol/L MnCl2组相比,在100μmol/L利鲁唑干预组中,GS和Na+-K+-ATPase的活力明显增加,GS、GLAST及GLT-1 mRNA表达和蛋白水平也均显著增加。结论1、MnCl2可致大鼠纹状体内Glu代谢转运异常,利鲁唑对其具有一定的保护作用。2、MnCl2可对星形胶质细胞产生毒性作用,利鲁唑对其具有防护作用。3、利鲁唑可抑制MnCl2导致的星形胶质细胞Glu代谢转运障碍。