一、研究背景糖皮质激素局部注射治疗肌腱病或者全身使用治疗自身免疫性疾病导致的肌腱自发性断裂在临床上非常常见。这种肌腱的自发性断裂较急性创伤引起的肌腱断裂手术修复效果差,远期易再次发生断裂。然而其机制尚不清楚。而众所周知,成体组织中原位的成体干细胞池对成体组织的更新和自身修复非常重要。最近,相继在人、小鼠、大鼠、兔的肌腱中分离纯化出一群具有多向分化潜能的成体干细胞,被命名为肌腱干细胞(tendon stem cells,TSCs),虽然其只占肌腱所有细胞的5-6%,但它向损伤部位迁移并向肌腱细胞正常分化对肌腱损伤修复非常重要。因此探讨糖皮质激素对TSCs增殖、分化和迁移的影响对阐明糖皮质激素导致肌腱自发性断裂以及断裂之后修复困难的机制非常重要。二、研究目的通过选取糖皮质激素的一种最具代表药物地塞米松(dexamethasone,Dex)研究不同浓度Dex对大鼠肌腱干细胞(rat tendon stem cells,r TSCs)增殖、分化和迁移的影响;阐明Dex抑制r TSCs向肌腱细胞分化,促进肌腱干细胞向脂肪细胞分化,抑制肌腱干细胞迁移的机制,最终阐明糖皮质激素导致肌腱自发断裂、肌腱自身修复能力降低的机制及针对由此导致的肌腱断裂寻找治疗方案。三、研究方法(1)、r TSCs分离、培养以及Dex对r TSCs增殖的影响首先通过I型胶原酶消化和在显微镜下挑取克隆的方法对rTSCs进行分离,通过流式细胞鉴定技术对r TSCs表面标志物CD44、CD90以及通过免疫荧光对胞内标志物Nucleostemin、SSEA-4进行鉴定,通过三系诱导对rTSCs成骨、成软骨、成脂分化能力进行鉴定。通过CCK-8法研究不同浓度Dex对rTSCs增殖的影响,进一步通过Ki-67法研究1uM Dex对rTSCs增殖的影响。(2)、Dex对rTSCs分化的影响及其机制研究1)、Dex对rTSCs分化的影响首先我们通过he染色和抗i型胶原免疫组化染色比较了正常的人体跟腱组织和长期使用糖皮质激素导致断裂的跟腱组织,接着我们通过流式细胞技术研究了1umdex对rtscs中cd44和cd90阳性细胞比例的影响,qpcr检测比较了不同浓度dex对rtscs成肌腱分化转录因子scx和成脂分化转录因子c/ebpαmrna表达的影响。通过qpcr和wb检测成肌腱分化标志物i型胶原(typeicollagen,coli)、tenomodulin(tnmd)和成脂分化标志物ap2、ccaat-enhancer-bindingproteinsα(c/ebpα)mrna的表达和coli、ap2、c/ebpα蛋白的表达,通过观察细胞形态变化、油红染色和通过免疫荧光染色检测coli、ap2来研究dex对rtscs分化的影响。2)、scleraxis(scx)在dex抑制rtscs向肌腱细胞分化的作用首先通过抗scx免疫组化染色比较了正常人体跟腱组织和因长期使用糖皮质激素导致断裂的跟腱组织scx表达的差异,接着通过体外实验研究dex对rtscs表达scx的影响以及dex通过糖皮质激素受体(glucocorticoidreceptor,gr)与scx基因启动子上游可能的结合位点,通过转染scx过表达和干扰质粒后,通过观察rtscs形态变化以及通过qpcr检测成肌腱分化标志物coli、tnmd的表达,研究scx在dex抑制rtscs成肌腱分化中的作用,通过gene-mapper和chip-sequence预测gr与scx基因上游2000bp可能的结合位点,进一步通过chip-pcr验证预测的结合位点是否为gr与scx上游dna片段真正的结合位点。3)、dkk1/gsk-3β/β-catenin在dex促进rtscs向脂肪细胞分化的作用dex作用rtscs以后,通过qpcr筛选经典与非经典的wnt信号通路配体,发现dkk1高表达。通过转染dkk1shrna干扰质粒以及licl处理后,通过wb检测p-gsk-3β(ser9)和p-gsk-3β(tyr216)以及活性β-catenin的蛋白变化,分别采用qpcr和wb方法检测成脂分化标志物ap2、c/ebpαmrna和蛋白的表达以及通过油红染色检测成熟的脂肪细胞形成研究dkk1/gsk-3β/β-catenin在dex诱导rtscs成脂分化中的作用。(3)、dex对rtscs迁移的影响及其机制研究1)、dex对rtscs迁移的影响将1umdex作用于rtscs,采用鬼笔环肽染色研究了dex对rtscs细胞骨架的影响,通过划痕实验、transwell实验观察dex对rtscs横向和纵向迁移的影响。2)、rock1和rock2在dex抑制rtscs迁移的作用首先通过qpcr和wb研究了dex对rock1和rock2mrna和蛋白表达的影响,使用rocks分子的抑制剂y-27632以及rock2慢病毒干扰作用于rtscs以后,通过细胞划痕实验和transwell实验研究rock1和rock2在dex抑制rtscs迁移中的作用。(4)、统计学方法实验所得各组细胞荧光强度值以均值x±s.e表示,采用spss13.0统计软件进行t检验或two-wayanova分析,方差齐性检验后组间两两比较采用tamhane检验,p<0.05为差异具有统计学意义。四、研究结果1、rtscs表达间充质干细胞表面标志物及具有多向分化潜能本课题组从大鼠跟腱分离的p0代肌腱干细胞呈现鹅卵石样,通过流式细胞鉴定发现细胞群体中cd44和cd90阳性细胞数均超过90%以上,而通过免疫荧光染色检测ssea-4和nucleostemin发现,ssea-4在胞浆中表达,而nucleostemin在胞核中大量表达。肌腱干细胞经过成骨、成脂、成软骨培养诱导21天以后,分别通过茜素红染色、油红染色、甲苯胺蓝染色检测发现,本课题组分离得到的rtscs具有向成骨、成脂、成软骨分化的能力。2、低浓度dex促进rtscs增殖,高浓度dex抑制rtscs增殖使用0nm、1nm、10nm、100nm、1umdex处理rtscs6h、12h、24h、48h,通过cck-8试剂处理检测发现,10nmdex促进rtscs增殖,1umdex抑制rtscs增殖。12h、24h、48h后,1nm、10nmdex促进rtscs增殖,而100nm、1um抑制rtscs增殖。通过抗ki-67免疫荧光染色检测进一步证实1umdex抑制rtscs增殖。3、dex抑制rtscs向肌腱细胞分化,促进其向脂肪细胞分化he染色和抗i型胶原免疫组化染色结果显示正常跟腱组织胶原纤维排列整齐、紧密,i型胶原高表达,而糖皮质激素导致断裂的跟腱组织中胶原纤维素排列紊乱、疏松,其间有类似脂肪组织化生,i型胶原表达量降低。正常培养和dex作用3天以后,cd44和cd90阳性细胞比例均较3天前显著降低,dex组较正常培养组cd44和cd90阳性细胞比例显著降低。使用1umdex处理p0rtscs1、3、5、7日,处理7日观察发现dex处理组较对照组长梭形细胞形成减少,通过抗coli免疫荧光检测发现dex处理组coli表达量较对照组低,抗ap2免疫荧光检测发现有大量ap2阳性细胞形成。通过流式细胞检测发现,cd44和cd90阳性细胞比例均较对照组减少。处理1、3、5、7日,成肌腱分化标志物coli、tnmd均较对照组低,随着时间的延长,实验组coli和tnmdmrna表达量呈增高趋势,而成脂分化标志物c/ebpα和ap2均较对照组表达增高,且随着时间延长,c/ebpα和ap2表达逐渐增高。采用0nm、1nm、10nm、100nm、1umdex处理rtscs3日,通过qpcr检测发现,1nmdex对rtscsscleraxis和c/ebpα表达无显著影响,10nmdex促进rtscsscx表达,100nm对scx表达无影响,1umdex抑制scx表达,10nmdex抑制c/ebpα的表达,100nm、1umdex促进c/ebpα的表达。1umdex处理rtscs3、5、7天后,coli表达量均较对照组降低,而c/ebpα和ap2均较对照组增高。1umdex处理rtscs21天后,通过油红染色检测发现,dex处理组有成熟脂肪细胞形成。4、dex通过scx抑制rtscs向肌腱细胞分化将1umdex作用rtscs1、3、5、7天,scx表达显著降低,而采用gr拮抗剂mi处理以后,mi能拮抗dex诱导的scx表达降低。作用7天后,dex从蛋白水平抑制scx表达,mi能拮抗dex诱导的scx表达降低。说明dex通过与gr结合抑制scx表达。采用gene-mapper和chip-sequence预测gr与scx上游2000bpdna可能的结合位点,共预测了3个。分别是-726~-734碱基ggcaaggt、-1711~-1729碱基atcctgtcctacaagact、-1710~-1723碱基atcctgtcctaca,并针对这3个位点设计引物,通过chip-pcr检测发现,dex能促进gr与scx上游-726~-734碱基ggcaaggt结合。shrna干扰scx,结果显示肌腱细胞标志物基因tnmd和i型胶原表达下降,转染shrna质粒组长梭形细胞显著减少。转染了scx过表达的质粒以后tscs中长梭形细胞显著增加,而且肌腱细胞的标志物coli和tnmd的mrna表达显著增加。5、dex通过dkk1/gsk-3β/β-catenin促进rtscs向脂肪细胞分化将1umdex作用rtscs3、5、7、14天,通过qpcr检测发现,dex组较对照组上调dkk1的表达,而通过wb检测发现dex也从翻译水平上调dkk1的表达。dex作用rtscs3天,通过wb检测发现p-gsk-3β(ser9)、p-gsk-3β(tyr216)和活性β-catenin的表达均无变化。dex作用rtscs5天、7天时,p-gsk-3β(ser9)显著下调,而p-gsk-3β(tyr216)显著上调,活性β-catenin注下调。dex作用rtscs7天,通过免疫组化检测发现,dex显著下调活性β-catenin蛋白表达。向rtscs转染dkk1shrna干扰质粒,dkk1干扰能够减弱dex诱导的p-gsk-3β(ser9)下调、p-gsk-3β(tyr216)上调、活性β-catenin的下调。同时,dkk1干扰能减弱dex诱导的rtscs向脂肪细胞分化。使用gsk-3β激活剂licl,同样能减弱dex诱导的p-gsk-3β(ser9)下调、p-gsk-3β(tyr216)上调、活性β-catenin的下调。同时,licl能减弱dex诱导的rtscs向脂肪细胞分化。6、Dex抑制rTSCs迁移将1uM Dex作用r TSCs24h后,通过细胞划痕实验和细胞transwell实验发现,Dex显著抑制r TSCs迁移,同时我们发现Dex作用rTSCs1、3、5、7天,通过qPCR和WB检测发现,Dex组较对照组显著升高ROCK1和ROCK2 m RNA和蛋白的表达,不改变Rho A的表达。7、ROCKs在Dex抑制rTSCs迁移的作用通过划痕实验和transwell迁移实验研究了Dex与Y27632对r TSCs迁移的影响,划痕12h、24h后,分别在显微镜下结果显示:Y27632加快rTSCs的侧向迁移,减弱Dex对rTSCs侧向迁移的抑制作用。将小室放在24孔板24h后,通过结晶紫染色在显微镜下结果显示:Y27632加快rTSCs的纵向迁移,减弱Dex对rTSCs纵向迁移的抑制作用。通过转染慢病毒干扰r TSCs ROCK2的表达。细胞划痕实验和transwell迁移实验结果显示ROCK2干扰能促进rTSCs横向和纵向迁移,且ROCK2干扰能拮抗Dex对r TSCs横向迁和纵向迁移的抑制作用。五、结论1、本实验以酶消化法成功分离获得了rTSCs,获得的细胞形态和免疫表型及多向分化能力符合MSCs的表型特征。本研究结果提示低浓度(1nM、10n M)Dex显著促进rTSCs增殖,而高浓度(100n M、1u M)Dex显著抑制rTSCs增殖。2、本实验证实低浓度Dex促进rTSCs成肌腱分化的转录因子Scx表达,抑制成脂肪细胞分化转录因子C/EBPα的表达,而高浓度Dex抑制r TSCs表达Scx,促进其其表达C/EBPα。高浓度Dex作用于受体以后,受体与成肌腱分化的关键转录因子Scx的启动子上游-726~-734碱基GGCAAGGT结合,抑制其表达,从而抑制rTSCs向肌腱细胞分化。我们的结果证实Dex诱导的rTSCs向脂肪细胞分化是由DKK1/GSK-3β/β-catenin介导的。DKK1的下调或者GSK-3β抑制剂是拮抗糖皮质激素诱导肌腱干细胞向脂肪细胞分化的靶点。3、本实验证实Dex改变r TSCs细胞骨架结构,抑制rTSCs横向和纵向迁移。本实验证实Dex通过上调ROCKs抑制r TSCs迁移,ROCKs上调如何影响r TSCs迁移尚需进一步研究。