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重组蛋白在大肠杆菌Escherichia coli中表达时的三种定位方式中,与胞内和周质空间相比,胞外定位具有获取产品容易,下游纯化简便等优点,有利于工业生产。本实验室前期研究发现,无信号肽的Thermobifida fusca角质酶在大肠杆菌中表达时,能够折叠成为有活性的蛋白,可以限制性水解细胞膜磷脂组分,提升膜通透性,强化重组目标蛋白的胞外表达。然而,T.fusca角质酶水解磷脂SN-1或SN-2位酯键的产物溶血磷脂在高密度培养中极易诱发大量泡沫,不利于发酵过程调控。磷脂酶C能够水解磷脂分子C 3位点的磷脂酰键,产生甘油二酯和磷酸胆碱,可能具有与角质酶相似的强化目标蛋白胞外表达的应用性能,并且能够避免角质酶易产生泡沫的弊端。本研究首先考察了无信号肽的Bacillus cereus磷脂酶C(本论文研究的磷脂酶C均为无信号肽磷脂酶C)在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中的表达情况,进一步构建了B.cereus磷脂酶C和模型蛋白(包括天然胞外和胞内定位型蛋白)共表达的重组菌,通过比较该重组菌和模型蛋白单独表达对照菌的产酶情况,探究了共表达B.cereus磷脂酶C对模型蛋白胞外产量的影响。主要研究结果如下:1.磷脂酶C在大肠杆菌中的表达:提取B.cereus基因组为模板,设计引物PCR获得无信号肽磷脂酶C编码基因。将该基因连接到表达载体p ETDuet-1第一个多克隆位点,构建了重组质粒p ETDuet-1-plc;将该质粒转入E.coli BL21(DE3)获得重组菌E.coli BL21(DE3)/p ETDuet-1-plc,摇瓶发酵20 h后,胞外上清磷脂酶C酶活达到14.2 U?m L-1,约占总酶活的95.3%。此外,检测发现发酵结束时菌体细胞呈现不规则形态但未明显裂解,与T.fusca角质酶在大肠杆菌中表达时的现象类似。2.磷脂酶C与天然胞外定位模型蛋白共表达:分别构建了β-半乳糖苷酶(86 k Da)、α-环糊精葡萄糖基转移酶(76 k Da)、木聚糖酶(43 k Da)与磷脂酶C共表达的重组菌。摇瓶发酵结果显示上述重组菌的生产强度分别是模型蛋白单独表达时的89.2%、2.7倍和4.0倍。表明共表达磷脂酶C强化胞外定位型重组蛋白胞外表达的程度与其分子量有关:分子量过大时,无强化效果;分子量较小时,强化效果明显。在此基础上,将分子量最小的木聚糖酶进行纯化定性,发现其单独表达以及与磷脂酶C共表达时获得的酶的最适p H、最适温度、比活力等性质相似。将单独表达和与磷脂酶C共表达木聚糖酶的两种重组菌在3 L罐以同样条件进行高密度发酵,结果显示,与磷脂酶C共表达的重组菌发酵过程中未发生明显的起泡现象,胞外上清中木聚糖酶酶活最高值为678.6 U·m L-1,约占总酶活的80%,生产强度约为21.7 U·m L-1·h-1,为其单独表达对照菌的1.8倍。3.磷脂酶C与天然胞内定位的模型蛋白共表达:分别构建了异淀粉酶(79 k Da)、海藻糖合酶(66 k Da)、葡萄糖异构酶(42 k Da)与磷脂酶C共表达的重组菌。摇瓶发酵结果显示上述重组菌胞外上清模型蛋白酶活分别占总酶活的0%、35.2%和92.7%,而单独表达模型蛋白的重组菌胞外始终检测不到相应模型蛋白酶活。表明共表达磷脂酶C促进胞内定位型重组蛋白胞外表达的程度与重组蛋白分子量的关系和胞外分泌型蛋白相似。选择分子量最小的葡萄糖异构酶进行纯化定性,其单独表达以及与磷脂酶C共表达时获得的酶最适p H、最适温度、比活力等性质相似。将共表达磷脂酶C和葡萄糖异构酶的重组菌在3 L罐进行高密度发酵,结果显示,发酵过程中没有明显起泡现象,胞外上清中葡萄糖异构酶酶活最高值达到17.7 U?m L-1,约占总酶活的85%。