研究目的叶绿酸f是由本课题组最近研制开发的具有自主知识产权的新型光敏剂,其基本的光动力学特性以及对膀胱癌的光动力杀伤效果和机制尚不清楚。本研究旨在明确叶绿酸f的制备流程及其光动力学特性,探讨其介导的光动力学作用对膀胱癌细胞的体外杀伤效果及其可能的机制,为其下一步的临床应用提供坚实的基础理论支持。研究方法1、首先从原料中药蚕砂中提取得到叶绿素粗制品,经碱水解、分离、提取、纯化等步骤得到纯度极高的叶绿酸e6,再由叶绿酸e6制备叶绿酸f以及其对应的钠盐。2、采用高压液相色谱(High Performance Liquid Chromatography, HPLC)分析叶绿酸f样品的纯度,质谱仪(Mass spectrometry, MS)分析叶绿酸f分子量,荧光分光光度计分析其吸收光谱,应用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)检测其产生1O2的能力。3、体外培养膀胱癌5637和T24细胞到对数生长期,然后应用CCK-8法检测不同浓度的叶绿酸f在不同能量密度的650nm波长激光激发下对膀胱癌5637和T24细胞的生长抑制作用,倒置显微镜下观测膀胱癌细胞的形态学改变。4、将叶绿酸f与5637和T24细胞孵育4h后,再用线粒体特异性探针标记线粒体,应用激光共聚焦显微镜(Confocal laser scanning microscope,CLSM)检测叶绿酸f在细胞内的亚细胞分布；对叶绿酸f光动力学治疗(Photodynamic therapy, PDT)12h后的5637和T24细胞应用DAPI染色,荧光显微镜下观测细胞的形态学改变；采用流式细胞仪(Flow cytometry, FCM)分析叶绿酸f光动力学处理12h后5637和T24细胞的凋亡率。5、采用细胞凋亡蛋白抗体芯片技术检测5637和T24细胞光动力处理前后bad、bax、BID、BIM、Bc1-2、 Bc1-w、Caspase-3、Caspase-8和细胞色素C、XIAP、SMAC等凋亡相关蛋白的表达情况,探讨叶绿酸f光动力学作用诱导5637和T24细胞凋亡的可能机理。6、将叶绿酸f与5637和T24细胞孵育2h后,应用溶酶体特异性探针标记溶酶体,激光共聚焦显微镜下观测叶绿酸f在细胞内的亚细胞分布；westernb lot方法检测叶绿酸f光动力学处理前后5637和T24细胞中LC3, Beclinl蛋白的表达情况；分别应用Cyto-ID(?)自噬特异性染料、单丹磺酰戊二胺(Monodansylcadaverin, MDC)、吖啶橙(Acridine Orange, AO)染料对叶绿酸f光动力学处理后的5637和T24细胞进行染色,然后激光共聚焦显微镜下观测细胞的形态学改变；透射电镜(Transmission Electron Microscope,TE M)下观察叶绿酸f光动力学处理1h后5637和T24细胞超微结构的变化。7、应用自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)对5637和T24细胞进行预处理1h,然后给与f-PDT处理,分别采用CCK-8法以及流式细胞仪分析叶绿酸f光动力学处理后5637和T24细胞的生长抑制率和凋亡率。研究结果1、制得的叶绿酸f样品纯度为90.19%,相对分子量为539.3,其吸收峰为653.5nm,599.0nm,501.5nm以及398.5nm,其中398.5nm和653.5nm处吸收峰最强；叶绿酸f与DPBF溶液共孵育后,采用波长为405nnm,能量密度为40mW/cm2的红光分别激发15s,30s,45s,60,75s,荧光光谱仪结果显示DPBF的荧光强度随着激光激发时间的延长而逐渐下降。2、叶绿酸f各浓度1、2和4ug/ml对5637细胞生长抑制率在4J/cm2下分别为33.92%、57.38%和84.88%,在2J/cm2则相应为25.4%、51.21%和70.09%,各浓度2.5ug/m1.5ug/m1.10ug/ml对T24细胞生长抑制率在4J/cm2下分别为34.03%、60.11%和86.51%,在2J/cm2为31.79%、53.83%和72.89%。3、5637和T24细胞先后与叶绿酸f,线粒体探针孵育后,激光共聚焦显微镜结果显示400nm激发叶绿酸f发出的红色自身荧光与488nm激发线粒体探针产生的绿色荧光分布基本一致。4、荧光显微镜下DAPI染色结果可见f-PDT处理后5637和T24细胞均出现胞核边缘不规则,核固缩,核溶解、碎裂,核小体碎片增加等细胞凋亡的典型特征,而空白对照组细胞则未见到明显的凋亡细胞。5、5637细胞在4ug/ml叶绿酸f和4J/cm2,650nm激光条件下,光动力处理后,行流式细胞检测,细胞凋亡率为50.61±1.66%,细胞对照组凋亡率为4.05±0.12%;T24细胞在10ug/ml叶绿酸f和4J/cm2,650nm激光条件下,光动力处理后,流式细胞仪检测细胞的凋亡率为54.3±1.32%,细胞对照组凋亡率为11.31±0.71%。两种细胞中PDT处理组与细胞对照组之间差异有显著性意义(P<0.01)。6、在5637细胞PDT处理组中促凋亡蛋白bad.BID.BIM较对照组有不同程度的升高,分别为对照组的1.25倍,1.38倍和1.23倍；而抗凋亡蛋白Bcl-2与Bcl-w相较于对照组则有明显的下降,分别为对照组的0.25倍和0.48倍；处理组细胞色素C水平高于对照组,是对照组的1.32倍；Caspase3相较于处理组也有一定程度的升高,为对照组的1.35倍,Caspase8则相对于对照组无明显改变；凋亡抑制蛋白XIAP处理组明显低于对照组,是对照组的0.34倍；促凋亡蛋白SMAC处理组则高于对照组,为对照组的1.14倍。在T24细胞处理组中促凋亡蛋白bad.bax.BID BI M较对照组有不同程度的升高,分别为对照组的2.39倍,1.55倍,2.06倍和1.19倍；而抗凋亡蛋白Bcl-2与Bcl-w相较于对照组均有一定程度的下降,分别为对照组的0.83和0.82倍;处理组细胞色素C水平高于对照组,是对照组的1.55倍；Caspase3和Caspase8处理组对比对照组均有一定程度的升高,分别为对照组的1.42倍和1.18倍；凋亡抑制蛋白XIAP处理组低于对照组,是对照组的0.82倍：促凋亡蛋白SMAC处理组高于对照组,为对照组的1.35倍。7、两种细胞与叶绿酸f孵育2h后,再与溶酶体探针孵育,激光共聚焦显微镜结果显示叶绿酸f自身的红色荧光与504nm激发溶酶体探针产生的绿色荧光分布基本一致。8、Beclin1和LC3-II蛋白在5637和T24细胞PDT处理组中表达增高,均呈一定的时间依赖性。9、Cyto-ID(?)自噬特异性绿色染料,MDC以及AO染色后,激光共聚焦结果显示5637和T24细胞内在f-PDT后1h,2h和4h均先后形成自噬体(lutophagosomes),晚期自噬体以及自噬溶酶体(lutolysosomes)结构。10、5637和T24细胞光动力学处理后,透射电镜检测显示细胞内很多双层膜样结构的自噬体,其内部可见到胞质成分以及受损的细胞器。对照组无相应改变。11、3-MA预处理+PDT处理组中5637细胞的生长抑制率为93.52%,而对应的PDT处理组中5637细胞的生长抑制率则为83.15%,3-MA对照组细胞生长抑制率为6.73%;同时3-MA预处理+PDT处理组中T24细胞的生长抑制率为95.51%,对应的T24细胞PDT处理组中的细胞生长抑制率为86.19%,3-MA对照组细胞生长抑制率则为5.78%。12、流式细胞术结果显示,3-MA预处理+PDT处理组中5637细胞的凋亡率69.454±2.14%,而对应的PDT处理组中5637细胞的凋亡率则为50.61±1.66%；同时3-MA预处理+PDT处理组中T24细胞的凋亡率为77.69±1.75,对应的T24细胞PDT处理组中的细胞凋亡率为54.3±1.32%。两种细胞中3-MA预处理+PDT处理组与PDT处理组之间差异有显著性意义(P<0.05)。研究结论1、制备的叶绿酸f纯度高,光学特性符合理想光敏剂要求。2、叶绿酸f结合650nnm激光,体外光动力作用杀伤膀胱癌5637和T24效果显著,具有药物剂量和激光能量依赖性。3、叶绿酸f可以定位在膀胱癌细胞溶酶体以及线粒体中,首先诱导膀胱癌细胞发生自噬,然后通过诱导细胞凋亡实现对肿瘤细胞的杀伤。4、5637和T24细胞经PDT处理后,促凋亡蛋白bad、bax、BID、BIM等水平不同程度升高,而抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-w等出现一定程度的下降,细胞色素C、SMAC 及 XIAP等从线粒体中被释放入细胞浆,综合作用激活下游的Caspase-3等分子,从而诱导膀胱癌细胞发生凋亡。5、自噬在f-PDT处理膀胱癌细胞的过程中发挥细胞保护的作用,联合应用自噬抑制剂与f-PDT可以进一步提高PDT对膀胱癌的杀伤效果。