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皮肤是机体免于脱水、损伤和感染的第一道防线,是维持内环境稳定和阻止微生物、化学物质等侵入的屏障[1]。皮肤组织的创伤修复及组织再生是整形烧伤及创伤外科中常见的问题及挑战,临床常用的修复方法存在着许多缺点,如:治疗时间长,造成供区的额外损伤,大面积烧伤患者缺乏足够的自体皮肤等。干细胞研究及以其为基础的再生医学,尤其是iPS细胞技术的产生和它本身具备的优越性为创面的修复提供了新的途径和希望。但由于iPS细胞技术产生至今才短短八年时间,将它运用于皮肤创伤的研究还是一个新兴的领域。目前研究显示iPS细胞在诱导剂的作用下可有效分化为角质形成细胞,但其对皮肤创伤愈合的作用却尚未报道。因此,本研究拟观察iPS细胞源性角质形成细胞移植治疗小鼠皮肤创伤的作用,并初步揭示其发挥作用的相关机制。从而深化iPS细胞技术运用于皮肤创伤的研究。一.miPSc源性角质形成细胞(miPSc-KCs)移植对小鼠皮肤创面愈合的作用(一)目的在载体(in vivo)水平探讨miPSc-KC移植对小鼠皮肤创面愈合的作用。(二)方法1.运用含维甲酸(RA)和骨形成蛋白4(BMP4)的分化培养基诱导miPSc分化为角质形成细胞(KC),利用免疫荧光染色检测K14和P63在miPSc-KC的蛋白表达。2.采用手术剪除的方法建立C57BL/6小鼠背部全层皮肤创伤模型,并将模型分为两组,将PBS或miPSc-KCs注射到小鼠创口四周,即为PBS组和miPSc-KCs 组。3.分别在不同时间点(术后第3、5、7和14天)取材,统计创面愈合情况。4.对创面组织切面后进行苏木精-伊红(HE)染色、Masson三色染色及免疫组化染色,观察创面再上皮化、真皮改建和胶原积累状况、附属器发育状况等并量化对比。5.将用绿色荧光染料CFSE标记的miPSc-KCs注射到小鼠皮肤创伤四周,术后第14天用冰冻切片观察创面中miPSc-KCs的移植情况。(三)结果1.miPSc-KCs表达角质形成细胞的标志蛋白。2.成功建立小鼠背部全层皮肤创伤模型,小鼠正常存活,无全身性不良反应和严重感染发生。3.miPSc-KCs组的小鼠皮肤创面面积比PBS组显著性减小。4.HE染色、Masson三色染色及免疫组化染色显示miPSc-KCs组的小鼠皮肤创面的再上皮化比PBS组显著性增强;miPSc-KCs组的小鼠皮肤创面愈合后瘢痕面积比PBS组显著性减小;miPSc-KCs组的小鼠皮肤创面愈合后附属器比PBS组显著性增多。5.术后第14天的创面再上皮化部位可见绿色荧光表达。(四)结论1.miPSc-KCs移植后能迁移到小鼠皮肤创面,参与并促进再上皮化,从而促进创面愈合。2.miPSc-KCs移植能促进小鼠皮肤创伤愈合后皮肤附属器的形成,并抑制瘢痕的形成。二.miPSc-KCs条件培养基(miPSc-KCs-CM)对小鼠成纤维细胞胶原蛋白表达的影响及作用机制(一)目的在细胞(in vitro)水平探讨miPSc-KCs-CM对小鼠成纤维细胞胶原蛋白表达的影响及可能的作用机制。(二)方法1.培养 miPSc-KCs 48 小时后收集上清,获得 miPSc-KCs-CM。miPSc-KCs-CM或KBM培养基(control)分别培养小鼠成纤维细胞。48 h后,提取成纤维细胞 mRNA,real time-PCR 测定 miPSc-KCs-CM 组和 control 组细胞中collagenⅠ、collagenⅢ mRNA 的表达水平。2.ELISA方法检测不同时间点收集的miPSc-KCs-CM中TNF-的浓度。3.在miPSc-KCs-CM中加入TNF-α中和抗体,培养小鼠皮肤成纤维细胞48小时,Real time-PCR测定小鼠皮肤成纤维细胞中collagenl、collagenⅢ mRNA的表达水平。4.miPSc-KCs-CM、miPSc-KCs-CM+TNF-α 中和抗体、KBM 培养基(control)分别培养小鼠皮肤成纤维细胞48小时,提取成纤维细胞mRNA,real time-PCR测定小鼠皮肤成纤维细胞中collagenⅠ、collagenⅢ mRNA的表达水平。5.miPSc-KCs-CM、miPSc-KCs-CM+TNF-α 中和抗体、KBM 培养基(control)分别培养小鼠皮肤成纤维细胞48小时,免疫荧光染色检测p65在细胞核中的表达水平。(三)结果1.miPSc-KCs-CM显著性降低了小鼠皮肤成纤维细胞中collagen Ⅰ、collagen ⅢmRNA的表达。2.miPSc-KCs-CM中有TNF-α表达,在24小时含量达到最高值。3.TNF-α中和抗体能部分补偿miPSc-KCs-CM对成纤维细胞collagen Ⅰ、collagen Ⅲ mRNA表达的抑制作用。4.miPSc-KCs-CM激活小鼠皮肤成纤维细胞中NF-κB(四)结论1.miPSc-KCs-CM 可以抑制 collagen Ⅰ、collagen Ⅲ 表达。2.miPSc-KCs-CM 中含有 TNF-α,并在抑制 collagen Ⅰ、collagen Ⅲ 表达中发挥作用,其中的机制可能是通过激活NF-κB信号通路。