研究背景糖尿病（diabetes mellitus，DM）是一种多病因引起的内分泌代谢疾病，是由胰岛素分泌及／或作用缺陷引起的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱，其特点是慢性高血糖。糖尿病的根本危害在于其各种并发症，糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是其重要的慢性并发症之一，是导致糖尿病晚期死亡的主要原因。研究糖尿病心肌病的发病机制，探讨葡萄子原花青素（grape seed proanthocyanidin extracts，GSPE）对糖尿病大鼠心肌的保护机制，对延缓糖尿病心肌病的病理进程，改善预后，降低死亡率有重要的临床意义。糖尿病慢性并发症的发病机制包括：糖基化终末产物（AGEs）途径、多元醇途径、蛋白激酶C（PKC）激活途径、己糖胺途径和氧化应激等。高糖情况下，以上机制共同作用，引起一系列病理变化。其中AGEs途径仍为研究重点。随着分子生物学研究水平的提高，非酶糖化研究不断深入，AGEs、糖基化终末产物的受体（receptor for advanced glycaton end products，RAGE）、核因子κB（neuclear factor kappaB，NF-κB）及多种细胞因子、炎症因子的发现，其相互之间的复杂联系在诱发和促进糖尿病并发症，尤其是糖尿病心肌病的发生、发展中的作用，越来越受到人们的重视。AGEs发挥作用的一个重要途径便是通过与内皮细胞等细胞膜上的特异受体RAGE结合，引起细胞因子、激素、氧自由基等可溶性物质含量的改变，导致多种蛋白基因表达水平的改变，参与细胞凋亡过程，引发一系列代谢紊乱，这可能是导致糖尿病并发症的关键途径。抗RAGE抗体或sRAGE阻断AGEs与RAGE相互作用能逆转糖尿病心血管并发症的进展。GSPE是从葡萄子中提取的多酚类化合物，具有很强的抗氧化活性，还具有抗动脉硬化和调节血脂等作用，对糖尿病大鼠心肌损害方面的干预研究，国内外尚未见报道。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，运用GSPE进行干预，采用透射电镜、HE、PAS、MASSON染色、免疫组织化学及RT-PCR等方法，同时测定血浆中AGEs等指标，从蛋白质和基因水平上探讨糖尿病心肌病的发病机制和观察GSPE对糖尿病大鼠心肌病的干预效果，并探讨其作用机制。目的：本研究通过链脲佐菌素（streptozocin，STZ）诱导糖尿病大鼠动物模型，应用GSPE进行治疗干预，在此基础上，观察24周，旨在探讨糖尿病心肌病的发病机制，研究GSPE对糖尿病心肌病的干预作用。方法：雄性Wistar大鼠尾静脉注射0.1％STZ以建立糖尿病模型，成模后随机分为2组，糖尿病对照组（DM1组，n=8）和糖尿病GSPE治疗组（GSPE250mg／kg／d，DM2组，n=12），另设2组，正常对照组（C1组，n=10）和正常GSPE治疗组（GSPE 250mg／kg／d，C2组，n=10）。观察24周后，处死大鼠，采血测空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）、糖化血红蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA_1C)、AGEs等指标：对各组进行HE、PAS、MASSON染色，观察糖尿病大鼠心脏组织的病理改变；应用透射电镜观察心肌超微结构改变；应用免疫组织化学方法观察RAGE、核因子-κB（neuclear factor kappaB，NF-κB）、转化生长因子β₁（transforming growth factorβ₁，TGF-β₁）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）在心脏组织中的表达情况；半定量PT-PCR方法检测大鼠心脏组织RAGE、NF-κB、TGF-β₁和CTGF基因表达情况。结果：1．一般观察：实验过程中，DM1组大鼠呈现明显多尿、多饮、多食及消瘦，皮毛污秽无光泽，生长缓慢；DM2组糖尿病大鼠上述表现减轻，C1组、C2组大鼠无糖尿病表现，生长及营养状况良好。实验开始4组大鼠体重差异无统计学意义；实验结束时，C1、C2组体重差异无统计学意义，DM1、DM2组之间差异无统计学意义，DM1组比C1组体重明显下降（P＜0.001）。C1组与C2组肝肾功能差异无统计学意义。DM1组和DM2组相比，FPG、HbA_1C差异无统计学意义；FPG、HbA_1C在DM1组比C1组明显升高（P＜0.001，P＜0.001）。2．血清AGEs浓度测定：24周后AGEs在DM1组比C1组和DM2组明显升高。3．心脏组织病理改变：（1） HE、PAS、MASSON染色发现：C1组和C2组心肌纤维无肥大，细胞核呈圆形或椭圆形，居于细胞中央，心肌间质结构正常；心肌纤维结构正常，心肌组织中无明显PAS阳性物质沉积；心肌胶原纤维分布均匀。DM1组心肌细胞肥大，深染，边界不清，细胞核大小不均匀。心肌纤维有局灶性坏死，可见炎性细胞浸润。心肌纤维中PAS阳性物质多见。心肌胶原纤维分布不均匀，排列紊乱，相互连接成网状。以上改变在C1组、C2组和DM2组大鼠心肌纤维中少见。（2）免疫组织化学观察发现，RAGE、NF-κB、TGF-β₁和CTGF在DM1组心肌组织中表达明显增强，DM2组表达明显减弱，在C1组和C2组中只有轻微的表达。4．心肌细胞超微结构改变：实验结束时，电镜下观察各组大鼠心肌组织切片。C1组：心肌细胞核形规则，异染色质较少；肌原纤维和线粒体排列有序，线粒体嵴丰富；闰盘结构正常；基膜与心肌细胞膜完整。C2组：肌原纤维和线粒体排列有序，线粒体嵴丰富，T小管和肌浆网无肿胀。DM1组：心肌细胞核周池肿胀；胞质和核周出现高电子密度脂质颗粒；肌原纤维和线粒体排列紊乱，线粒体大小及形状不一，肌浆网轻度肿胀；闰盘结构轻度异常。DM2组：心肌细胞核形较规则，染色质分布尚可，核周无肿胀；闰盘结构正常；肌原纤维排列尚规则，肌膜外基膜完整；部分线粒体大小不一，肿胀。异常结构较DM1组明显改善。5．PT-PCR结果：实验大鼠心肌组织基因表达检测中，RAGE、NF-κ3、TGF-β₁和CTGF mRNA在DM1组表达水平明显升高，DM2组各基因表达水平明显降低。RAGE、NF-κB、TGF-β₁和CTGF mRNA电泳带光密度的图像处理分析结果显示DM1组心肌组织基因RAGE／GAPDH、NF-κB／GAPDH、TGF-β₁／GAPDH、CTGF／GAPDH相对值明显高于C1组，经GSPE治疗后，各相对值比DM1组显著降低。结论：1．AGEs／RAGE和NF-κB参与了糖尿病心肌病的发生、发展；2．GSPE可以通过阻断AGEs／RAGE／NF-κB的结合效应对糖尿病大鼠心肌起到保护作用：（1） GSPE可以改善糖尿病大鼠心脏病理学形态；（2） GSPE可以改善糖尿病大鼠心肌超微结构；（3） GSPE可以降低糖尿病大鼠心脏TGF-β₁和CTGF mRNA表达水平，参与抑制糖尿病大鼠心肌纤维化的过程，减轻其心肌损害。3．葡萄子原花青素为天然植物成分，本研究为预防和治疗糖尿病心肌损害的新药研发提供了重要的理论参考依据。意义：本研究发现，在STZ诱导的糖尿病大鼠动物模型中，糖代谢异常可引起AGEs的升高，AGEs发挥作用的一个重要途径就是通过与心肌细胞上的特异性受体RAGE结合，诱导发生氧化应激反应，激活NF-κB，引起心肌细胞中细胞因子TGF-β₁、CTGF的表达增加，导致大鼠心肌的损伤，促进糖尿病心肌病的发生、发展。GSPE具有多种生物学特性，它可通过阻断AGEs／RAGE的结合效应，阻断NF-κB和RAGE介导的信号转导途径，改善糖尿病大鼠心肌的损害。GSPE为天然植物成分，本研究为预防和治疗糖尿病心肌损害的新药研发提供了重要的理论参考依据。