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目的 用RNA干扰技术特异性抑制VEGF基因在乳腺癌细胞MCF-7的表达。 方法 体外转录合成针对VEGFmRNA的siRNA,使用脂质体转染的方法导入细胞,观察转染后癌细胞的变化,MTT法检测细胞存活率,RT-PCR检测转染后VEGFmRNA表达水平的变化,ELISA检测蛋白表达的下降效果。 结果 所设计的两个靶位点均能有效抑制肿瘤细胞的生长,而作为阴性对照的错义序列组siRNA完全不起作用。转染后24小时各组MCF-7细胞MTT代谢率的统计结果显示:低、中、高剂量组的MTT代谢率明显低于正常对照组,与正常对照组比较有高度统计学意义（P<0.01）:极高剂量组的MTT代谢率也低于正常对照组,其与正常对照组比较有统计学意义（P<0.05）。错义序列组(即siRNASCR组)、脂质体组与正常对照组比较没有显著差异（P>0.05）。转染后24小时siRNA1和siRNA2组的RT-PCR结果显示其VEGFmRNA表达量明显下降。转染后24小时siRNA1和siRNA2组的VEGF分泌含量明显低于正常对照细胞组等其它3组,siRNA1和siRNA2组与正常对照组比较有高度统计学意义。 结论 应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖,为肿瘤的基因治疗提供了新思路。本文应用所设计的针对VEGF基因的两组siRNA,转染在体外培养状态下的人乳腺癌细胞系MCF-7,结果显示无论从细胞水平、mRNA水平还是蛋白水平,都对VEGF基因的表达发挥出明显的抑制效果。从而得出在细胞水平上RNAi可成功应用于肿瘤的基因治疗的结论,为其临床应用提供理论基础。同时提示我们在乳腺癌的抗血管生成基因治疗中VEGF可以成为有效的靶位点。本文成功应用生物软件所设计出来的两个靶位点均能有效抑制VEGF蛋白的分泌、表达及人乳腺癌细胞系MCF-7细胞的增殖,为下一步动物试验打下良好的基础。验证了应用RNA干扰技术可以有效抑制肿瘤细胞的增殖,为肿瘤的基因治疗提供了新思路。siRNA能够成功应用于体外培养的乳腺癌细胞系作为基因治疗肿瘤的临床前试验,极有可能成为未来肿瘤基因治疗的生物类新兴药物。 实验所用体外转录试剂盒所转录出来的siRNA纯度高,可直接应用于体外培养细胞的转染。脂质体转染试剂脂质体2000转染siRNA的效率比较高,可以基本满足试验需要。脂质体带正电,可以靠静电作用结合到RNA的磷酸骨架上以及带负电的细胞膜表面。带负电的RNA自动结合到带正电的脂质体上,形成RNA-阳离子脂质体复合物。转染时避免使用抗生素和血清以提高转染效率。脂质体作为一种载体把siRNA带入细胞内,其与siRNA有个最佳质量比例,统计结果显示质量比为1: