论文部分内容阅读
【研究背景】大肠癌（CRC)是发病率较高的消化道恶性肿瘤之一，在世界最常见恶性肿瘤中列第四位，死亡率已跃居恶性肿瘤第二位，在我国恶性肿瘤中列第三位。由于对大肠癌的早期诊断率相对较低，发现时多处于中晚期，术后易发生复发转移，因此对于大肠癌的早期诊断成为了近年来研究的重点。目前，在肿瘤的形态学诊断方面仍然依靠病理科医师个人经验和对肿瘤细胞的识别能力，缺乏客观判定指标和数据一。因此，探讨种新的、能够观察其形貌特征、更客观、更准确、更早地识别癌前病变和早期癌细胞学改变的方法和技术，具有重要的学术价值和临床意义。原子力显微镜（AFM)是一种具有纳米级或亚纳米级的超高分辨率、能对细胞的超微结构和机械性能进行精确成像的分析仪器。它是由Binning等在1986年由扫描隧道显微镜的基础之上研制而成的，并在当时获得了诺贝尔物理学奖。其所具有其他显微技术所不具备的成像优势：1.可以观察到的标本范围非常广泛，标本可以是金属、半金属及绝缘体等，都可以用原子力显微镜进行观察；2.具有极高的分辨率，能清晰地观测到原子分子的形貌结构及力学特征；3.成像环境要求低，既可在空气中成像，也可在其他的环境中成像；4.成像时间短，可及时准确的得到标本的三维形貌图；5.探针如得到修饰以后可用于判别特定的分子及其相互的作用力，因此近年来被广泛应用于包括临床医学在内的各个领域，特别是观察肿瘤细胞的机械性能与超微结构方面，显示出其良好的应用前景。但目前对于大肠癌细胞株的形貌学特征的观察研究鲜见报道。【研究目的】本研究通过普通光镜和原子力显微镜对比观察大肠癌细胞株HT-29(HT-29)和耐5-FU的大肠癌细胞株HCT-8/5-FU (HCT-8/5-FU)的形貌学改变；对比观察经过5-FU处理、不同阶段的HT-29和HCT-8/5-FU两组细胞株的动态形貌学特征；探讨原子力显微镜在大肠癌细胞形貌学检测方面的应用价值，对比分析普通光学显微镜下主观判断的肿瘤形态学改变与原子力显微镜所分析的客观数值间的相关性。为癌前病变及大肠癌的早期病理形态学诊断探索新途径；为应用化疗药物后根据大肠癌细胞形貌学改变判定耐药与否等提供一个新思路。【研究方法】本实验分为三个部分：1.采用细胞印片法和细胞爬片法分别对正常大肠上皮细胞和大肠癌细胞株HT-29进行制片，然后利用倒置相差显微镜和原子力显微镜对比观察正常大肠上皮细胞和大肠癌细胞株HT-29的细胞形貌学特征。2.通过细胞培养及耐药株的建立（HCT-8/5-FU)，采用细胞爬片法制片，利用倒置相差显微镜及原子力显微镜对HT-29和HCT-8/5-FU两组细胞株的形貌特征进行对比观察。3.采用5ug/ml5-FU分别处理大肠癌细胞株HT-29和HCT-8/5-FU2h和6h后，利用倒置相差显微镜及原子力显微镜对应用化疗药物处理后不同时段两组细胞的形貌特征进行对比观察。【研究结果】1.普通光镜下观察大肠正常上皮细胞与大肠癌细胞株HT-29,只能看到形状及大小不同，没有客观数值。原子力显微镜扫描分析结果：大肠癌细胞株HT-29细胞直径25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面积差值2.511±1.254;大肠正常上皮细胞：直径11.482±2.314、平均粗糙度13.105±6.307、平均峰高度7.827±2.673、平均凹陷程度-18.837±7.265、表面积差值1.894±0.675；两组有显著的统计学差异（P <0.05)，可量化评估。2.普通光镜下观察大肠癌细胞株HT-29和耐药株HCT-8/5-FU,只能看到形状及大小不同，没有客观数值。原子力显微镜扫描分析结果：耐药株HCT-8/5-FU细胞直径30.175士5.247、平均粗糙度98.750±10.460、平均峰高度16.856±2.673、平均凹陷程度-30.524±7.265及表面积差值5.278±1.175；大肠癌细胞株HT-29细胞直径25.684±6.265、平均粗糙度94.800±11.375、平均峰高度11.764±3.278、平均凹陷程度-24.863±8.386及表面积差值2.511±1.254；两组有显著的统计学差异（P<0.05)，可量化评估。3-.普通光镜下观察经5-FU处理2、6小时后大肠癌细胞株HT29和耐药株HCT-8/5-FU细胞数量减少、细胞大小轻度改变，没有客观数值。原子力显微镜扫描分析结果：大肠癌细胞株HT-29在0h、2h、6h的动态观察过程中，细胞直径25.684±6.265、31.356±5.018、49.073±4.147，平均粗糙度94.800±11.375、98.175±10.269、115.234±9.656，平均峰高度11.764±3.278、15.678±2.768、26.359±2.051，平均凹陷程度-24.863±8.386、-29.476±6—.712、35.317±6.018，表面积差值2.511±1.254、2.959±0.976、6.768+0.873五个客观数值均有明显改变（P<0.05)；而耐药株HCT-8/5-FU细胞经5-FU处理0h，2h、6h后，细胞直径30.175±5.247，31.979±4.317、35.073±4.205，平均粗糙度98.750±10.460，99.265±9.475、101.670±9.015，平均峰高度16.856±2.673，17.569±2-.113、19.478±1.964，平均凹陷程度30.524±7.265-，31.263±6-.055、32.456+5.798，表面积差值5.278±1.175，5.924±1.013、6.567±0.927五个客观数值比较无统计学差异（P>0.05)。此外，两种细胞株在5-FU处理Oh和6h的细胞直径、平均粗糙度、平均峰高度、平均凹陷程度及表面积差值五个客观数值比较有显著差异（P<0-.05);5FU处理2h的五个客观数值两组比较无统计学意义（P>0.05)。【研究结论】1-.原子力显微镜扫描观察正常大肠上皮细胞和大肠癌细胞株HT29的细胞形貌学特征，可以得出客观数值（普通光学显微镜所观察不到的、精细的形貌特征数据），有助于量化判定细胞的良恶性。提示原子力显微镜形貌学观察可以用于大肠癌细胞的客观判定。2.原子力显微镜形貌学特征量化分析非耐药株HT-29与耐药株HCT-8/5-FU精细的形貌学特征，有助于从形貌学改变判别耐药与否。3.原子力显微镜扫描观察5ug/ml5-FU处理的HT-29和HCT-8/5-FU细胞株发现，经5-FU处理前及处理后2、6小时形貌学特征动态性数值变化，有助于根据形貌学改变判断肿瘤细胞是否发生耐药或对化疗药物敏感。