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目的1采用野百合碱（Monocrotaline,MCT）一次性腹腔注射,诱导大鼠肺动脉高压（P ulmonary Arterial Hypertension,PAH）模型,同时给予白藜芦醇（Resveratrol,RE S）预处理,通过观察大鼠一般情况,检测大鼠生存率、体重、血流动力学参数以及肺动脉重构情况来探究RES是否具有抗PAH效应;通过检测MCT-PAH大鼠肺组织以及血清偶联因子6（Coupling Factor 6,CF6）和前列环素（Prostacyclin,PGI2）水平,来探讨RES抗PAH作用机制。2采用原代培养大鼠肺动脉平滑肌细胞（Pulmonary Artery Smooth Muscle Ce lls,PASMC）,给予CF6刺激,验证其是否具有促进PASMC增殖作用,同时给予RES处理以验证RES是否能够抑制CF6诱导的PASMC增殖,并进一步探讨其作用机制。方法1 RES对MCT诱导大鼠PAH保护作用以及其对CF6/PGI2调控作用:1.1实验动物及分组:健康雄性SD大鼠共计40只,随机分为3组,即:对照组（n=12）,MCT组（n=15）和RES组（n=13）,总计饲养4周。1.2模型建立以及药物干预:采用给予SD大鼠一次性腹腔注射MCT（60mg/kg）的方法来诱导PAH模型。RES组大鼠给予一次性腹腔注射MCT（60mg/kg）,然后每日清晨行RES（25mg/kg）灌胃;MCT组大鼠给予一次性腹腔注射MCT（60mg/kg）,然后每日清晨给予与RES组等效容量的溶媒灌胃;对照组大鼠给予一次性腹腔注射与MCT组等效容量的溶媒,然后每日清晨给予与RES组等效容量的溶媒灌胃。1.3实验动物一般情况、生存率以及体重检测:饲养过程中注意观察大鼠的体格发育、活动能力、进食情况、粪便形态、毛发色泽、是否紫绀以及眼神表现等。实验结束后计算各组大鼠的生存率。各组大鼠每周进行体重检测并记录。1.4血流动力学指标检测:实验进行4周后,各组大鼠行右心导管术,测定右心房压力（Right Atrial Prssure,RAP）、右心室收缩期最大压力上升速率（RV+dp/d tmax）、右室舒张期最大压力下降速率（RV-dP/dtmax）、肺动脉收缩压（Pulmonary A rterial Systolic Pressure,PASP）以及肺动脉舒张压（Pulmonary Artery Dystoli c Pressure,PADP）,并计算肺动脉平均压（mean Pulmonary Arterial Pressure,mP AP）。1.5心肺组织大体标本检测:切取双侧肺组织,快速称重双肺质量,并计算肺湿重指数（Lung Wet Weight Index,LWWI）;分离右心室（Right Ventricle,RV）游离室壁组织以及左心室+室间隔（Left Ventricle+Septum,LV+S）组织,快速称重并计算右心室质量指数（Right Ventricular Mass Index,RVMI）和右心室肥厚指数（Ri ght Ventricular Hypertrophy Index,RVHI）。1.6肺动脉病理学检测:肺组织行HE染色并测定肺小动脉（直径50-100μm）相对中膜厚度（Ratio of Medial Thickness,RMT）、相对管腔面积（Ratio of Vesse l Area,RVA）;免疫组化法检测腺泡内微动脉（直径<50μm）α-平滑肌肌动蛋白（Smo oth Muscle Actin,SMA）的表达,计算腺泡内微动脉肌化程度（Muscularization,M R）,并测定α-SMA阳性信号平均光密度（Mean Optical Density,MOD）。1.7 CF6表达测定:免疫组化法检测肺小动脉CF6的表达,免疫印迹法检测肺组织CF6的表达,ELISA法测定血清CF6水平。1.8 PGI2表达测定:ELISA法测定肺组织匀浆以及血清PGI2代谢产物6-ketoP GF1a水平。2 RES抑制CF6诱导的PASMC增殖作用机制探讨:2.1大鼠PASMC增殖检测:应用不同浓度的CF6刺激PASMC,另外在CF6刺激的基础上给予RES或PP1（Src蛋白磷酸化特异性抑制剂）处理,采用CCK-8法检测细胞增殖率[细胞增殖率（%）=（实验组OD值-空白对照组OD值）/（正常细胞组OD值-空白对照组OD值）],细胞分组方法如下:（1）CF6对PASMC增殖的影响:CF6组（CF6刺激浓度为25nM、50nM、100nM、150nM和200nM）、正常细胞组和空白对照组。（2）RES对CF6诱导PASMC增殖的影响:CF6组（CF6刺激浓度为100nM）、C F6+RES组（加入100nM CF6和10μM、20μM、50μM、80μM、100μM RES）、正常细胞组和空白对照组。（3）PP1对CF6诱导PASMC增殖的影响:CF6组（CF6刺激浓度为100nM）、C F6+PP1组（加入100nM CF6和5μM、10μM、20μM、30μM、40μM PP1）、正常细胞组和空白对照组。2.2 RES细胞毒性检测:采用CCK-8法检测不同浓度RES作用下的细胞活性率[细胞活性率（%）=（RES组OD值-空白对照组OD值）/（正常细胞组OD值-空白对照组OD值）],将PASMC分为空白对照组、正常细胞组和RES组（10μM、20μM、50μM、80μM和100μM）。2.3 Src蛋白磷酸化水平检测:采用免疫印迹法检测PASMC Src蛋白磷酸化水平。（1）CF6诱导PASMC Src蛋白磷酸化水平:100nM CF6刺激PASMC,分别于0m in、20 min、40 min、60 min检测Src蛋白磷酸化水平.（2）RES及PP1对CF6诱导的PASMC Src蛋白磷酸化水平的影响:细胞分为C F6组（CF6刺激浓度100nM）、CF6+RES组（100nM CF6+50μM RES）、CF6+PP1组:（100nM CF6+30μM PP1）和正常细胞组,各组反应40min后检测PASMC Src蛋白磷酸化水平。结果1 RES对MCT诱导大鼠PAH保护作用以及其对CF6/PGI2调控作用:1.1大鼠一般情况、生存率以及体重结果:MCT注射3周后,MCT组大鼠均出现呼吸急促,口唇紫绀,目光呆滞,活动能力下降,毛发杂乱干枯,进食较少,体型消瘦,大便疳积,并随时间的延长而加重,RES组大鼠只有3只出现进食减少,体型稍瘦,并逐渐出现呼吸急促以及口唇紫绀等情况。至实验结束时,MCT组大鼠生存率较对照组明显降低（P<0.05）,RES组生存率较MCT组升高（P<0.05）。在3、4周末时,MCT组大鼠体重较对照组明显降低（P<0.05）,而RES组大鼠体重高于M CT组（P<0.05）。1.2血流动力学指标检测结果:MCT组大鼠RAP、PASP、PADP和mPAP均明显高于对照组（P<0.05）;RES组大鼠RAP、PASP、PADP和mPAP水平较MCT组降低（P<0.05）。MCT组大鼠RV+dp/dtmax及RV-dP/dtmax均较对照组降低（P<0.05）;与MCT组比较,RES组大鼠RV+dp/dtmax升高（P<0.05）,而RV-dP/dtmax差异无统计学意义（P>0.05）。1.3心肺组织大体标本检测结果:MCT组大鼠LWWI、RVMI以及RVHI明显高于对照组（P<0.05）;RES组大鼠LWWI、RVMI以及RVHI较MCT组降低（P<0.05）。1.4肺动脉病理学检测结果:与对照组比较,MCT组大鼠RMT升高（P<0.05）,而RVA降低（P<0.05）;与MCT组比较,RES组大鼠RMT降低（P<0.05）,而RVA升高（P<0.05）。MCT组大鼠腺泡内微动脉MR及α-SMA染色MOD较对照组明显升高（P<0.05）;RES组大鼠腺泡内微动脉MR及α-SMA染色MOD较MCT组降低（P<0.05）。1.5 CF6表达测定结果:免疫组化结果显示,MCT组大鼠肺小动脉CF6染色MOD较对照组明显升高（P<0.05）,RES组大鼠肺小动脉CF6染色MOD较MCT组降低（P<0.05）;免疫印迹结果显示,MCT组大鼠CF6蛋白表达较对照组增加,（P<0.05）,RES组大鼠CF6蛋白表达较MCT组降低（P<0.05）;ELISA结果显示,MCT组大鼠血清CF6蛋白水平较对照组明显升高（P<0.05）;RES组大鼠血清CF6蛋白水平较MC T组降低（P<0.05）。1.6 PGI2表达测定:MCT组大鼠肺组织匀浆以及血清6-ketoPGF1a蛋白水平较对照组明显降低（P<0.05）,RES组大鼠肺组织匀浆以及血清6-ketoPGF1a蛋白水平较MCT组升高（P<0.05）。2 RES抑制CF6诱导的PASMC增殖作用机制探讨:2.1大鼠PASMC增殖检测结果:与正常细胞组比较,CF6组PASMC增殖率均升高（P<0.05）,且呈剂量依赖性,CF6峰值效应浓度为100nM;在CF6（100nM）刺激的同时给予不同浓度的RES或PP1处理,PASMC增殖率均降低（P<0.05）,且RES或P P1抑制CF6诱导的PASNC增殖作用呈剂量依赖性（P<0.05）,RES峰值效应浓度为50μM,PP1峰值效应浓度为30μM。2.2 RES细胞毒性检测结果:与正常细胞组比较,各不同浓度RES组PASMC活性率差异均无统计学意义（P<0.05）。2.3 Src蛋白磷酸化水平检测结果:CF6（100nM）刺激PASMC Src蛋白磷酸化达峰时间为40min;在CF6（100nM）刺激的同时,给予RES（50μM）或PP1（30μM）处理40min,Src蛋白磷酸化水平降低（P<0.05）。结论1 RES预处理能够降低MCT-PAH大鼠肺动脉压力,减轻肺动脉重构。2 RES预处理可能通过抑制MCT-PAH大鼠CF6的合成而促进PGI2的表达,从而发挥抗PAH作用。3 CF6可能通过促进Src蛋白磷酸化而诱导PASMC增殖,RES可能通过阻断Src蛋白磷酸化,从而起到抑制CF6诱导的PASMC增殖作用。