【摘 要】
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近年来,血栓性疾病发病率逐年攀升,对人类健康造成严重危害,而且全球心血管类疾病的死亡率居高不下,因此对血栓性疾病的预防和治疗迫在眉睫。纤溶酶能专一性水解纤维蛋白,而微生物来源的纤溶酶是当前研究的热点,粗糙脉孢菌是一种具有生长周期短,生产成本低,产酶速度快和酶安全性高优势的丝状真菌,已用于发酵制品中,经研究发现其代谢产物中具有纤溶活性的蛋白,而且此来源的纤溶酶未见报道,其可为开发安全高效价廉的新型溶
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近年来,血栓性疾病发病率逐年攀升,对人类健康造成严重危害,而且全球心血管类疾病的死亡率居高不下,因此对血栓性疾病的预防和治疗迫在眉睫。纤溶酶能专一性水解纤维蛋白,而微生物来源的纤溶酶是当前研究的热点,粗糙脉孢菌是一种具有生长周期短,生产成本低,产酶速度快和酶安全性高优势的丝状真菌,已用于发酵制品中,经研究发现其代谢产物中具有纤溶活性的蛋白,而且此来源的纤溶酶未见报道,其可为开发安全高效价廉的新型溶栓药物提供资源。因此本论文利用粗糙脉孢菌固态发酵生产纤溶酶,并针对该来源纤溶酶进行了下列研究:固态发酵条件优化、粗糙脉孢菌纤溶酶的分离纯化、酶学性质研究和体外条件下酶应用功能研究,得到以下主要研究成果:（1）首先利用粗糙脉孢菌固态发酵农业和工业副产物生产纤溶酶,通过单因素实验、Plackett-Burman设计、最陡爬坡试验和Box-Behnken设计进行发酵工艺优化,优化后培养基组成和发酵条件为:葵花籽粕与麦麸之比为10︰1,加液量96%（v/w）,培养基自然p H条件,接种量15%（v/w）,发酵温度28℃,发酵时间5 d,使最终发酵粗酶液纤溶酶活力达到403.59 U/m L,与未优化时相比,酶活力提高了近2倍。（2）经过40%～60%饱和度硫酸铵沉淀、透析、SP-Sepharose Fast Flow阳离子交换层析对发酵粗酶液进行分离纯化,目的酶比活力达到3614.94 U/mg,回收率4.91%,纯化倍数为17.89倍。由SDS-PAGE检测目的酶达到电泳纯,且相对分子量约为32 k Da。（3）目的酶的最适作用温度和p H分别为40℃和7.4,接近人体的生理环境,而且其在25～50℃范围内具有一定的热稳定性,在p H值为5.0～9.0范围内具有较高的活力。与对照组相比,金属离子Na+（119%）,Zn2+（119%）和Cu2+（132%）对纤溶酶活力具有显著激活作用,K+,Mg2+和Mn2+对酶活力的影响不显著,Ca2+（77%）和Fe2+（28%）对酶活力具有显著抑制作用。蛋白酶抑制剂对目的酶活力均表现不同程度抑制作用,N-对甲苯磺酰基-L-苯丙氨酸氯甲基酮（TPCK）和乙二胺四乙酸（EDTA）抑制作用不显著,胃蛋白酶抑制剂（68%）具有显著抑制作用,苯甲基磺酰氟（0%）、大豆胰蛋白酶抑制剂（0%）和抑肽酶（0%）完全抑制纤溶酶活力。巯基类试剂β-巯基乙醇（130%）对目的酶具有显著激活作用,而还原型谷胱甘肽（67%）和氧化型谷胱甘肽（71%）则抑制作用显著;变性剂尿素（54%）和十二烷基硫酸钠（0%）和有机试剂丙酮（85%）对目的酶具有显著抑制作用;蛋白胨（119%）具有显著激活作用,蔗糖、甘油、牛血清白蛋白（BSA）和赖氨酸对纤溶酶活力影响不显著。综上,目的酶的活性中心可能含有二硫键和丝氨酸,属于丝氨酸蛋白酶类。（4）目的酶在富含纤溶酶原和无纤溶酶原的纤维蛋白平板上的酶活力相差0.35%,说明目的酶不具有激酶活性,可直接溶解纤维蛋白。目的酶可以有效降解纤维蛋白原的3种多肽链,降解速度依次是:α链（5 min）＞β链（30 min）＞γ链（4 h）,而且目的酶不具有凝血酶样酶活性。体外探究目的酶对黑山羊血液的抗凝效果,发现含有目的酶的血液组在37℃保温24 h后只形成少量凝块,仍具有良好的流动性,而含有肝素钠（阳性对照）和生理盐水（阴性对照）的血液组完全凝固,说明目的酶在体外具有一定的抗凝血活性,具有被开发成为一种抗凝药物的潜力。同时研究目的酶对黑山羊血液凝块的溶解情况,4 h后,100 U纳豆激酶、100 U目的酶和生理盐水组的溶解率分别是1.34%、3.54%和0.06%,孵育24 h后分别达到8%、14%和0.13%,同剂量的目的酶对血液凝块溶解率高于纳豆激酶,说明目的酶具有一定的溶栓能力。体外模拟目的酶对血液和胃液环境的耐受力,在模拟血液环境中于37℃保温4 h后酶活力变化不显著,表明目的酶在短时间内可以耐受血液环境;将目的酶分别在模拟进食前、进食蔗糖和进食蛋白类物质后的胃液中于37℃保温4 h后时,相对酶活力分别为0%、0%和82%,表明目的酶在被蛋白类物质保护的情况下可以耐受胃液环境,推测该酶可能具有被开发成静脉注射和口服药物的潜力。
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