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胃癌(gastric cancer,GC)是一种常见的消化系统恶性肿瘤,在世界范围内是肿瘤相关死亡的重要原因。由于早期诊断技术以及治疗手段的改进,近年来胃癌的总体预后有所改善,但是晚期胃癌的临床结局并不令人满意,5年生存率较低。在后基因组时代,寻找胃癌新的分子标志物,构建早期敏感、特异、即时检测(point of care testing, POCT)的诊断方法以及研发单克隆抗体靶向治疗药物将是胃癌基础以及临床研究领域的热点。目前筛选胃癌分子标志物的方法以传统蛋白质组学策略为主,虽然已鉴定出一些新的胃癌分子标志物,但是由于这些分子特异性较差而停滞于实验室研究阶段,难以临床应用。筛选鉴定特异性强且定位于肿瘤细胞表面的靶点分子标志物将为胃癌的抗体靶向治疗开辟新的思路。本研究拟采用以制备的抗胃癌单克隆抗体反向筛选鉴定靶抗原的方法,旨在实现“一步法”同时制备抗胃癌细胞表面天然构象抗原的特异性单抗以及鉴定特异性胃癌分子标志物。由于传统的抗体筛选制备方法很难获得识别活细胞表面天然构象抗原的抗体,所以本研究采用“鸟枪法”活细胞免疫小鼠,杂交瘤技术结合流式细胞术高通量筛选的创新方法,在活细胞水平直接筛选抗肿瘤细胞表面天然构象抗原的特异性抗体,在进行抗体的特异性鉴定及分析特异性抗体识别的胃癌细胞表面天然抗原与胃癌临床病理学参数的相关性和临床意义之后,采用人蛋白质组芯片对制备的特异性抗体结合的靶抗原蛋白分子进行快捷鉴定,从而确定新的胃癌细胞表面分子标志物。本研究分为以下4个部分:一.抗胃癌细胞表面天然抗原特异性抗体的高通量筛选、制备研究方法:胃癌细胞株(SGC7901、BGC823、MKN28、MKN45)混合后免疫6-8周龄BALB/c小鼠(1×107个细胞),取脾脏B细胞与SP2/0细胞融合,杂交瘤细胞大批量铺板,选择性培养;利用BD FACS Calibur的高通量检测系统(fluorescence activating cell sorter-highthroughput screening system,FACS-HTS),在活细胞水平通过FACS高通量检测预处理的杂交瘤细胞培养上清与胃癌细胞(免疫用4株胃癌细胞)以及正常对照细胞(健康志愿者外周血单个核细胞,PBMC)的结合反应情况;根据ELISA-HTS(enzyme linked immunosorbentassay-HTS)的基本筛选原则,挑取杂交瘤细胞阳性克隆,再进行FACS交叉鉴定后建立能稳定分泌抗胃癌细胞表面天然构象抗原的单克隆抗体杂交瘤细胞株。制备的单克隆抗体进行亚型鉴定及ProteinA/G亲和层析纯化。研究结果:杂交瘤技术与活细胞水平FACS-HTS相结合的筛选方法制备获得两株抗胃癌细胞表面天然构象抗原的单克隆抗体,分别命名为MS38-2.1及MS40-3.1(根据高通量筛选鉴定过程中对杂交瘤细胞的特定编号)。两株抗体均为IgG1/κ型。研究结论:建立了“鸟枪法”胃癌活细胞免疫,杂交瘤技术结合活细胞水平FACS-HTS的创新方法,制备了两株抗胃癌细胞表面天然构象抗原的特异性抗体。本研究建立的创新方法也可用于其它实体肿瘤细胞表面天然构象抗原特异性抗体的制备、筛选。二.抗胃癌细胞表面天然抗原单抗的特异性鉴定研究方法:培养38种细胞系,包括15种胃癌细胞,以及结直肠癌、肝细胞肝癌、乳腺癌、胆囊癌以及急性单核细胞白血病细胞,人胎肝细胞和GES-1、EA.hy926细胞,采用间接免疫荧光染色、FACS检测MS38-2.1及MS40-3.1的标记情况。收集12例手术切除的胃癌新鲜组织及同一病例癌旁组织,部分组织分别进行酶消化后制备单细胞悬液,间接免疫荧光染色后FACS检测MS38-2.1及MS40-3.1与肿瘤细胞及癌旁组织细胞的免疫反应情况;剩余新鲜组织常规10%福尔马林固定,石蜡包埋,免疫组化EnVision法检测胃癌和癌旁组织两株抗体的标记情况。研究结果:FACS结果显示,MS38-2.1与胃癌细胞、GES-1细胞、结肠癌、肝细胞肝癌、L-02细胞、急性单核细胞白血病、乳腺癌以及胆囊癌细胞均有不同强度的结合反应,与EA.hy926细胞也有结合反应;MS40-3.1与胃癌细胞、GES-1细胞、结直肠癌、肝细胞肝癌及L-02细胞均有结合反应;两株抗体与对照细胞(包括健康志愿者PBMC以及正常胃黏膜上皮细胞)均无结合反应。免疫组化结果显示MS38-2.1及MS40-3.1可特异性标记胃癌细胞,并且MS38-2.1可特异性标记中小血管。FACS分析显示MS38-2.1及MS40-3.1与新鲜胃癌以及癌旁组织细胞结合反应的差异具有统计学意义(P <0.05)。研究结论:MS38-2.1识别的靶抗原蛋白分子在胃癌细胞、GES-1细胞、结肠癌、肝细胞肝癌、L-02细胞、急性单核细胞白血病、乳腺癌、胆囊癌细胞表面均有表达,并且在中小血管内皮细胞也有特异性表达;MS40-3.1识别的靶抗原蛋白分子在胃癌细胞、GES-1细胞、结直肠癌、肝细胞肝癌及L-02细胞表面均有表达。提示MS38-2.1和MS40-3.1均能特异性识别胃癌细胞,与正常胃黏膜上皮细胞无交叉反应。MS38-2.1还可特异性识别中小血管内皮细胞。三.特异性抗体识别的胃癌细胞表面天然抗原蛋白分子与胃癌临床病理学参数的相关性及临床意义研究方法:选取90例石蜡包埋的胃癌及对应癌旁组织标本,免疫组化EnVision法检测MS38-2.1及MS40-3.1的标记情况,并分析单抗识别的胃癌细胞表面天然抗原蛋白分子与胃癌临床病理学参数的相关性及临床意义。研究结果:90例胃癌及对应的癌旁组织中,28例胃癌组织MS38-2.1阳性(31.11%),8例癌旁组织阳性(8.89%),差异具有统计学意义(P<0.05);42例胃癌组织MS40-3.1阳性(46.67%),3例癌旁组织阳性(3.33%),差异具有统计学意义(P<0.05)。胃癌组织MS38-2.1及MS40-3.1标记阳性即MS38-2.1及MS40-3.1特异性识别的靶抗原蛋白分子均与肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期有关(P<0.05),而与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤部位以及肿瘤分化程度无明显相关性。生存分析显示,胃癌组织中MS38-2.1及MS40-3.1高阳性率即MS38-2.1及MS40-3.1特异性识别的靶抗原蛋白分子的高表达均与患者生存时间短有明显相关性(P<0.0001)。研究结论:MS38-2.1及MS40-3.1特异性识别的靶抗原蛋白分子在胃癌组织中均特异性高表达,且两个靶抗原蛋白分子的高表达均与胃癌的浸润、转移、临床分期和预后有关,可作为胃癌诊断及预后评估的潜在分子标志物。四.抗胃癌细胞表面天然抗原特异性抗体结合靶抗原蛋白的鉴定研究方法:培养胃癌细胞(BGC823、MKN28、SGC7901、MKN45),胃黏膜上皮细胞(GES-1),结肠癌细胞(SW1116),乳腺癌细胞(MCF-7)以及肝癌细胞(Hep3B),Western blot方法检测上述细胞中MS38-2.1及MS40-3.1特异性结合靶抗原蛋白的分子量及表达情况,以正常胃黏膜组织裂解物作为对照。采用包含16,368种不同人全长重组蛋白的蛋白质组芯片,鉴定MS38-2.1及MS40-3.1的特异性以及MS38-2.1及MS40-3.1特异性结合的靶抗原蛋白分子,ELISA及Western blot验证MS38-2.1及MS40-3.1与靶抗原蛋白分子的结合反应。研究结果:Western blot结果显示,抗胃癌单抗MS38-2.1识别的靶抗原蛋白分子在胃癌细胞BGC823、SGC7901、MKN45以及胃黏膜上皮细胞GES-1细胞表面高表达,在胃癌细胞MKN28细胞表面低表达;在结肠癌细胞SW1116,乳腺癌细胞MCF-7以及肝癌细胞Hep3B细胞表面均有表达;正常胃黏膜组织裂解物中不含这一蛋白分子。上述细胞表达的MS38-2.1特异性结合靶抗原蛋白的分子量约为128kDa。MS40-3.1识别的靶抗原蛋白分子在胃癌细胞BGC823、SGC7901、MKN28以及MKN45细胞表面高表达;在胃黏膜上皮细胞GES-1细胞表面高表达;在结肠癌细胞SW1116及肝癌细胞Hep3B细胞表面均表达;正常胃黏膜组织裂解物中不含这一蛋白分子。上述细胞表达的MS40-3.1特异性结合靶抗原蛋白的分子量约为60kDa。人蛋白质组芯片(human proteome microarray)鉴定结果显示,MS38-2.1特异性识别的蛋白分子为富含脯氨酸的小分子蛋白3(small proline-rich protein3,SPRR3), MS40-3.1特异性识别的蛋白分子为鸟氨酸脱羧酶1(ornithinedecarboxylase1,ODC-1),两株抗体与人蛋白质组芯片中其它细胞蛋白均无交叉反应。ELISA及Western blot显示MS38-2.1与人SPRR3重组蛋白,MS40-3.1与人ODC-1重组蛋白均有良好的特异性结合反应。研究结论:制备的MS38-2.1及MS40-3.1均为单一特异性单克隆抗体,MS38-2.1、MS40-3.1识别的靶抗原蛋白分子是与SPRR3、ODC-1类似或至少具有相同抗原表位的分子,为两个新的胃癌细胞表面候选分子标志物。综上所述,本研究建立了“鸟枪法”胃癌活细胞免疫,杂交瘤技术结合活细胞水平FACS-HTS,筛选制备抗胃癌细胞表面天然构象抗原特异性抗体的创新方法;发现了两个新的可作为胃癌诊断及预后评估的胃癌细胞表面分子标志物。本文建立的创新研究方法和结果对于其它恶性肿瘤分子标志物的研究具有重要的借鉴作用和参考价值。