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研究背景:随年龄增长而发生的心肌细胞进行性丢失是衰老心脏心功能下降和对缺血/再灌注损伤敏感性增加的主要原因,但作用机制不明。近年来的研究表明,源于一氧化氮（NO）的活性氮簇（Reactive Nitrogen Species,RNS）是细胞损伤的重要介质,RNS具有促凋亡和抗凋亡的双重作用,普遍认为低浓度/低活性的RNS（如:eNOS催化生成的NO.）具有细胞保护作用,高浓度/高活性的RNS(如:iNOS催化生成的NO.及其与超氧化物的双自由基反应产物ONOO-（过氧亚硝基）具有细胞毒性,而且异常细胞对ONOO-的细胞毒性比正常细胞更为敏感。大量临床和基础研究表明,衰老的心脏对心肌缺血等疾病易感性增加,但其具体机制仍处于探索之中。我们的前期研究发现,衰老的心肌组织中NO含量增高,但这种增高的病理生理意义并不清楚,特别是NO的这种增高是否导致衰老的心肌组织中RNS增高,进而使衰老的心脏对心肌缺血/再灌注损伤的敏感性增加等假说的研究尚未见文献报道。目的:1.观察衰老心肌组织中的NO及其衍生物（RNS）的含量变化;2.探讨衰老心肌组织中RNS含量变化的机制及其与衰老心脏对缺血/再灌注损伤易感性增加的关系。方法:选取健康雄性成年SD大鼠（4—6月龄）72只和老年SD大鼠（22—24月龄）90只,随机分为9组:①离体成年组（n=6）:离体心脏灌流不给予干预因素;②离体老年组（n=6）:离体心脏灌流不给予干预因素;③离体成年+腺苷组（n=6）:离体心脏灌流时加入腺苷溶液5μmol/L;④离体老年+腺苷组（n=6）:离体心脏灌流时加入腺苷溶液5μmol/L;⑤正常成年组（n=36）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉;⑥正常老年组（n=36）:经右侧颈总动脉插管进入大鼠左心室,监测心功能,不结扎冠状动脉;⑦成年心肌缺血/再灌注组（成年MI/R组n=24）:左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注3h;⑧老年心肌缺血/再灌注组（老年MI/R组n=24）;左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注3h;⑨老年缺血/再灌注组+1400W组（老年MI/R+1400W组n=18）:左冠状动脉前降支缺血30min,再灌注3h,缺血前24小时及再灌注前25分钟腹腔注射1400W（2mg/kg）。本实验用硝酸盐/亚硝酸盐比色测定试剂盒乳酸脱氢酶（LDH）法检测离体心脏灌流冠脉流出液中总一氧化氮（NOx）含量、在体监测各项心功能指标、以Evanse blue和TTC复染法检测缺血/再灌注后大鼠心肌梗死面积;以敏感性较高的TUNEL染色法和特异性较强的心肌组织caspase-3活性测定法检测心肌细胞凋亡程度、分别以免疫组织化学法和双抗体夹心ELISA法检测心肌组织硝基酪氨酸（NT）含量、以Western-blot法测定心肌细胞诱生型一氧化氮合酶（iNOS）的表达。结果:1.衰老心肌活性氮簇的改变1.1衰老心脏中基础NO.产生增加,但激动剂刺激的NO.产生减少用离体心肌灌流技术发现,成年大鼠心脏的NOx基础水平较低,注入腺苷后NOx产量明显增加（P＜0.01,图1）;老年大鼠心脏的NOx基础水平明显高于成年心脏（P＜0.01,图1）,然而注入腺苷后,NOx产量只有轻微升高。1.2老年大鼠心脏NOx的生物利用度降低VASP是cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶的下游靶物质,磷酸化VASP（pVASP）的减少是反映NO/cGMP信号转导的一种敏感性指征。我们的研究表明,尽管成年大鼠和衰老大鼠心脏中总VASP水平相当,但是老年大鼠pVASP水平却明显降低（P＜0.01,图2）。1.3老化心肌组织中硝基酪氨酸含量增加硝基化酪氨酸（NT）是表明ONOO-存在的“印迹”,本实验用免疫组织化学方法检测心肌组织中NT的含量来反映ONOO-的水平。结果显示,成年大鼠心肌组织中未测得硝基酪氨酸,而老年大鼠心肌组织中则大量表达（P＜0.01,图3）。2.衰老心肌对缺血/再灌注损伤易感性增加2.1不同年龄正常组大鼠细胞凋亡、心功能指标的改变2.1.1年龄因素对正常大鼠心肌细胞凋亡的影响正常老年大鼠心肌细胞的凋亡指数为（2.50±0.22%）、Caspase-3活性为（306±29μmol pNA/mg）,均高于正常成年组（0.70±0.15%、152±22μmol pNA/mg）（P＜0.05,表1,图7—9）。2.1.2年龄因素对正常大鼠心功能的影响与正常成年组比较,正常老年组大鼠左室舒张压（LVDP）和左室舒张末压（LVEDP）均显著升高（P＜0.01,图10,11）;正常老年组大鼠CI（心室收缩指数）（图12）和左心室内压最大上升速率(+dp/dtmax)均明显下降（P＜0.01,图12,13）。2.2不同年龄心肌缺血/再灌注组大鼠细胞凋亡、心梗面积、心功能指标的改变2.2.1年龄因素对缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡的影响与正常成年大鼠和正常老年大鼠相比,心肌缺血/再灌注均引起成年大鼠和老年大鼠显著的心肌细胞凋亡现象。老年大鼠缺血/再灌注区心肌细胞的凋亡指数为（19.0±2.1%）、Caspase-3活性为（436±35μmol pNA/mg）,均明显高于成年组（14.6±1.7%、340±32μmol pNA/mg,P＜0.05）（表1,图7—9）。2.2.2年龄因素对缺血/再灌注大鼠心梗面积的影响心肌缺血/再灌注后,老年大鼠心梗面积较成年大鼠明显增大（P＜0.05,表2,图14,图15b）。2.2.3年龄因素对缺血/再灌注大鼠心功能的影响与成年心肌缺血/再灌注组比较,老年心肌缺血/再灌注组大鼠LVDP升高（图16）、LVEDP升高（图17）、再灌注3h后左心室内压最大下降速率(-dp/dtmax)明显下降（P＜0.05,图18）;同时,与成年心肌缺血/再灌注组比较,心肌缺血/再灌注时老年大鼠CI明显下降（P＜0.05,图19）、再灌注3h后+dp/dtmax显著下降（P＜0.01,图20）。3.iNOS增高与衰老大鼠心肌缺血/再灌注损伤易感性增加有关3.1老年组大鼠心肌ONOO-含量增高本实验以心肌组织中NT的含量来反映ONOO-的水平,采用双抗体夹心ELISA法定量检测心肌组织硝基酪氨酸含量。结果表明,正常老年大鼠心肌组织NT含量较正常成年组升高（P＜0.05）;老年缺血/再灌注组心肌组织NT含量较成年缺血/再灌注组增高明显（P＜0.05,图21）。3.2老年组大鼠心肌iNOS表达增高与正常成年大鼠比较,正常老年大鼠iNOS表达升高（P＜0.05）;与成年缺血/再灌注组比较,老年缺血/再灌注组iNOS表达显著升高（P＜0.01,图22）。3.3给予iNOS阻断剂1400W使老年缺血/再灌注大鼠心肌NT含量下降为进一步证实iNOS表达的增加是否与老年心脏中NT的增加有关,我们用iNOS的特异性阻断剂1400W阻断iNOS后发现,缺血/再灌注后,老年大鼠心肌组织的NT明显下降（P＜0.05,表3,图21）。3.4给予iNOS阻断剂1400W使老年缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡减少、梗塞面积减小3.4.1给予1400W后老年缺血/再灌注大鼠心肌细胞凋亡减少用iNOS的特异性阻断剂1400W阻断iNOS后,老年缺血/再灌注+1400W组凋亡指数为（3.10±0.30%）、Caspase-3活性为（345±30μmol pNA/mg）,均低于老年缺血/再灌注组（19.00±2.10%、436±35μmol pNA/mg）（P＜0.05,表1,图7—9）。3.4.2给予1400W后老年缺8/再灌注大鼠梗塞面积减小用iNOS的特异性阻断剂1400W阻断iNOS后,老年心肌缺血/再灌注+1400W组大鼠心梗面积较老年心肌缺血/再灌注组明显减小（P＜0.05,表2,图14,15）。结论:①衰老使心肌对缺血/再灌注损伤易感性增加;②衰老使心肌细胞中的NO、ONOO-含量增高,尤以具有强细胞毒性的ONOO-增高为主;③衰老使心肌细胞中iNOS表达增高,这可能是衰老心肌细胞中NO、ONOO-含量增高,进而导致衰老心肌对缺血/再灌注损伤易感性增加的原因之一。