论文部分内容阅读
玉米、高粱等禾本科作物大斑病的病原菌为凸脐蠕孢菌(Setosphearia turcica)该菌被划分为玉米专化型(Setosphearia turcica f. sp. zeae)和高粱专化型(Setosphearia turcica f. sp. sorghi)。凸脐蠕孢菌专化型不侵染彼此的非亲和寄主,这种致病专化性反映了凸脐蠕孢菌专化型之间的致病差异。目前,尚无关于凸脐蠕孢菌专化型的致病专化机理和遗传基础方面的报道。本文对凸脐蠕孢菌专化型与寄主互作的致病性差异的分子机理进行了系统研究,深入分析凸脐蠕孢菌专化型产生致病专化性的相关致病差异基因,对揭示凸脐蠕孢菌专化型的致病专化性具有重要的理论意义。主要研究结果如下：1.我国玉米、高粱产区均存在凸脐蠕孢菌玉米专化型和高粱专化型,二者存在严格的致病力差异和遗传多样性利用形态学鉴定、ITS鉴定、鉴别寄主致病性测定和UP-PCR分析方法研究凸脐蠕孢菌专化型的鉴定和遗传多样性。结果显示：(1)凸脐蠕孢菌玉米专化型的地理分布较为广泛,高粱专化型的地理分布受气候和种植面积的局限,因此,专化型的致病专化性与地理分布不存在直接联系。(2)玉米专化型可以使玉米叶片上形成典型的梭形病斑,在高粱和苏丹草上仅出现由过敏性坏死反应导致的紫红色枯死斑。高粱专化型在高粱和苏丹草上均可形成典型病斑,在玉米上无症状表现。(3)UP-PCR分析能够反映出凸脐蠕孢菌专化型的致病专化性和遗传多样性之间的紧密联系,不能反映遗传多样性与地理分布之间的关系。不同专化型的菌株可被区分到不同的群组中,同一群组内的菌株均为同一种专化型,这与鉴别寄主交叉致病性试验和地理分布分析的结果一致。因此,UP-PCR技术可以作为辅助研究凸脐蠕孢菌专化型的有效手段。2.凸脐蠕蠕孢菌专化型的生物学表型存在异同利用生物学特性研究方法、生理生化指标测定、RT-PCR验证等方法对凸脐蠕孢菌专化型生物学表型进行测定比较。结果显示：(1)不同培养基,氮源,碳源,光照,温度,pH值,湿度条件下的凸脐蠕孢菌专化型的生物学表型表现出异同。(2)凸脐蠕孢菌专化型在附着胞形成、HT-毒素及次生代谢物成分、黑色素合成、细胞壁合成酶、细胞壁降解酶,漆酶,疏水性等生理生化及基因表达方面均存在异同。3.凸脐蠕孢菌专化型存在交互侵染差异机制对凸脐蠕孢菌专化型交互接种的样本,进行侵染表型比较、光学显微镜观察、扫描电镜观察、透射电镜观察、毒素生物活性测定及生理生化测定等研究,探讨凸脐蠕孢菌专化型在组织病理学方面的差异。结果显示：(1)凸脐蠕孢菌专化型对亲和寄主能够正常侵染。(2)凸脐蠕孢菌专化型对非亲和寄主表现为可以侵入,但不能扩展显症,细胞内观察显示病原菌往往局限于叶绿体,造成叶绿体部分解离或不分解,但不影响其生物功能。从寄主细胞结构变化上,植物细胞通常会产生抗性结构,如细胞壁折叠,细胞壁加厚,电子致密物质紧密排列,不定形性结构的出现等来抵御病原菌的侵染。(3)凸脐蠕孢菌专化型的毒素对亲和寄主及非亲和寄主的致病作用是伴随在机械损伤的基础上,对无机械损伤的非亲和寄主没有实质性的致病效果。(4)凸脐蠕孢菌专化型侵染亲和寄主后表现出细胞壁降解酶类随病程的延长而升高,叶绿素含量下降。侵染非亲和寄主后表现出细胞壁降解酶类略有上升,之后随病程的延长而趋于平稳,叶绿素含量略有上升或下降的波动,然后小幅上升,之后随病程的延长而趋于平稳。4.凸脐蠕孢菌专化型与寄主互作的转录组存在差异采用RNA-seq技术,对接种凸脐蠕孢菌专化型后第48 h的互作样本进行高通量测序,测序质检成功后,与凸脐蠕孢菌基因组进行比对,并选取相关致病差异基因进行qRT-PCR验证及GO富集和KEGG Pathway分析。结果表明：(1)基因的qRT-PCR验证结果与转录组测序结果一致。(2)差异基因的表达量,数量和类群存在异同。StSCK vs StSIN的差异基因总数、上调基因数、下调基因数及特异性差异基因数均少于StZCK vsStZIN。接种48h后,StSCK vs StSIN和StZCK vs StZIN的差异基因分别为1132和2549,特异性表达基因分别为399和1816,共同基因为733。StSCK vs StSIN的差异倍数log2Fold_change≥5的基因为47个,StZCK vs StZIN的差异倍数log2 Fold_change≥2.5的基因为61个。差异基因涉及的致病相关生物进程和功能较为相似,包括水解酶活性、氧化还原酶活性、碳水化合物代谢过程、组氨酸蛋白激酶活性等。(3)GO富集的基因种类和功能的存在差异。StSCK vs StSIN的GO富集包括生物进程、分子功能和细胞成分,GO显著富集于碳水化合物代谢,细胞壁组织化及其生物合成,水解O-glycosyl化合物和水解酶活性。StZCK vs StZIN的GO富集包括生物进程和分子功能,未出现显著富集。(4)KEGG Pathway的数量和种类存在差异。StSCK vs StSIN和StZCK vs StZIN的富集Pathway分别为22和35。在StSCK vs StSIN中,与致病相关的富集通路包括过氧物酶体、淀粉和糖代谢、次生代谢产物的生物合成、细胞色素P450、蛋白酶体等。在StZCK vs StZIN中与致病相关的富集通路包括淀粉和糖代谢、次生代谢产物的生物合成、脂肪酸代谢、微生物在不同环境条件下的代谢、蛋白酶体、谷胱甘肽代谢及MAPK信号途径—酵母途径等。5.凸脐蠕孢菌专化型的致病相关基因存在时间表达差异采用qRT-PCR技术监测相关致病基因的表达趋势。结果显示：(1)水解酶类基因检测结果显示,在2种专化型中,水解酶类基因StsPEL8、StsPEL9、StsBGL5、StzPEL5均体现出较丰富的表达水平,自48 h起,基因开始大幅上调,且基因的表达高峰点上存在差异。说明在病原菌侵染寄主后,水解酶类基因能够大量表达,即对降解细胞壁的成分均有正调控作用,辅助菌丝的扩展,有利于病程的发展。(2)氧化还原酶类基因检测结果显示：在2种专化型中,氧化还原酶类基因均体现出较丰富的表达水平,但各基因的表达规律存在差异。其中高粱专化型中StsCRAT、StsACOH、StsXDH基因均为上调表达,且随着病程延长,表达量继续上升,StsHMGCL基因在36 h和48 h略有下调,随着病程延长,表达量上升,基因上调。玉米专化型中StzPOD2基因显著上调为6-72 h,96-120 h出现下调。StzHMGCL基因在48 h略有下调,且随着病程延长,表达量继续上升。(3)蛋白激酶类及生长发育调节的基因表达检测显示：在2种专化型中,此类基因均体现出较丰富的表达水平,但各基因的表达规律存在差异。在高粱专化型中的StsPDE12、StsPKC13、StsPKC17基因随病程延长,出现显著上调表达。在玉米专化型中的StzSte20基因仅在6 h上调表达,StzRhol和StzHogl基因在48 h出现下调,随病程延长,出现显著上调表达。StzGlol、StzHsp72和StzPKC15均为上调表达。6.凸脐蠕孢菌专化型致病差异基因的功能预测利用转录组测序结果,选取致病差异基因的开放阅读框设计特异性引物进行DNA和48h互作样品cDNA的克隆分析和功能预测。结果显示：转录组结果与克隆结果一致。(1)凸脐蠕孢菌专化型的DNA克隆说明了StsACOXl基因和StzCypl基因存在于2种专化型菌株的基因组上,但cDNA克隆体现了两种基因对亲和寄主的特异性表达,在非寄主上没有表达。推测两种基因可能是引起凸脐蠕孢菌专化型致病专化性的差异基因。(2)StsACOXl基因编码368个氨基酸,分子量为43.3kD,理论等电点(pI)为9.88,分子式为C1892H2830N598O527S25。该蛋白没有跨膜域和信号肽,即未在生物膜上定位,不是信号蛋白,推测其常规调控胞内蛋白,属于ANK基因家族。StsACOX1蛋白与凸脐蠕孢菌的同源性最高,且具有进化特异性。StsACOX1基因的时间表达均为上调,但时高时低,72 h的表达量达到高峰。(3)StzCyp1基因编码501个氨基酸,分子量为55.8 kD,理论等电点(pI)为9.24,分子式为C2451H3916N694O725S34,该蛋白没有跨膜域和信号肽,即未定位在生物膜上,不属于信号蛋白,可能直接调控胞内蛋白,属于细胞色素450基因家族。StzCyp1蛋白与凸脐蠕孢菌、平脐蠕孢菌及离蠕孢菌的同源性高达100%,推测其不具有进化特异性。StzCyp1基因的时间表达均为上调,但时高时低,120 h的表达量达到高峰。