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目的对前期建立利用K562细胞ssDNA适配子检测方法条件的优化及评价研究,该方法对临床慢性粒细胞白血病的诊断应用价值。方法以合成的核苷酸适配子为模板并设计引物根据引物的Tm值,设置不同的退火温度,循环次数及引物浓度等,优化对称及不对称PCR扩增的条件,利用前期构建的方法使ssDNA适配子与K562细胞结合,筛选出最佳的ssDNA适配子组合并对检测条件进行优化,用最佳适配子组合与临床慢粒样本结合进行检测,在优化的检测条件下,以美国临床实验室标准化组织(Clinical and Laboratory Standards Institude,CLSI)的相关标准为依据,进行该方法的性能评估实验,参考《临床检验方法学评价》,以本项目建立的方法为候选方法,以金标准为参考方法,进行方法学评价研究,并作受试者工作曲线(ROC曲线),判断建立的方法是否能用于临床诊断。结果PCR扩增结果经3%琼脂糖凝胶电泳鉴定,对称PCR扩增条件的最佳退火温度为44.2℃,最佳循环次数为30次,间接不对称PCR循环次数为38次,非限制性引物与限制性引物浓度比例为50：1时可获得理想的ssDNA和较少的dsDNA。筛选得到最佳的适配子组合为生物素标记的5号ssDNA适配子与荧光素标记的3号ssDNA适配子组合。检测条件优化结果显示：最适的缓冲体系配方为8.0gNaCl,0.2gKCl,3.628gNa2HPO4·12H2O,0.24g KH2PO4,缓冲液pH为9.0,孵育温度为37℃,孵育时间为15min,最佳的荧光素标记ssDNA适配子浓度为100pmol,生物素标记ssDNA适配子浓度为150pmol,细胞数量浓度为800～1000×103/mL。对该方法进行方法学评价,其灵敏度高,检测阈值低,有较高的特异性,与预测值有线性关系且拟合度高,回归方程为：Y=1476.4+495.31X,r2=0.9766,批内精密度<5%,日间精密度>5%,试剂稳定性分析结果为：-20℃条件下,试剂可以稳定放置3周,在4-8℃条件下可以放置2周,在室温条件下能放置1天。对该方法的临床诊断性能评价研究显示,最佳的样本来源是静脉血提取的中性粒细胞,且慢粒样本的稳定性试验显示：-20℃条件下可以稳定放置4周,4-8℃条件下可以放置5天,室温条件下可以放置2天,准确度试验平均回收率为78.7%,干扰试验平均干扰率为43.6%。然后分别测定每个样本的荧光强度,并计算相应的平均数和标准差,经Independent Samples Test分析结果显示：病例组与易混淆病例组之间差异不显著t=1.227,p=0.287无统计学意义,病例组与健康体检组之间差异不显著t=2.159,p=0.097无统计学意义,易混淆病例组与健康体检组之间差异不显著t=1.618,p=0.181无统计学意义。最后作ROC曲线,以敏感度为纵坐标,(1-特异度)为横坐标绘制曲线,计算曲线下面积(AUC)为0.867,然后计算临床检验方法性能评价指标数值：敏感度为75%,特异度为77%,阳性似然比3.26,阴性似然比为0.32,误诊率为23%,漏诊率为25%,诊断效率为0.34,诊断指数为152,可靠度为0.306,可用度为0.52。结论前期建立的K562细胞ssDNA适配子检测方法本身灵敏度高,检测阈值低,特异性强,一定程度上为慢性粒细胞性白血病的分子诊断提供一种新思路；在对该方法临床诊断性能研究中,ROC曲线下面积为0.867,敏感度和特异度较好,有一定的临床诊断价值,但其抗干扰能力弱,重复性较差,且可靠度<0.5,因此该方法的临床应用还有一定的局限性。