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Skp2(S-phase kinase-associated protein 2) 是1995年Zhang H等人发现的与细胞周期S期激酶相关的蛋白。细胞中Skp2是作为泛素-蛋白酶体通路(ubiquitinproteasome pathway)中E3连接酶-SCF复合物(Skp-Cullin-F-box protein complex)的底物识别亚基来行使功能的。泛素-蛋白酶体通路由两步组成，先是由E1-E2-E3(ubiquitin-activation enzyme，ubiquitin-conjugating enzymes，ubiquitin-proteinligses)构成的级联反应泛素化修饰底物蛋白，后由proteasome降解，它在调控细胞周期、肿瘤的发生、发展与转移中具有重要的功能意义，也为细胞应激损伤反应后的核心转录因子p53、 NFrB等的功能调控所需要。SCF复合物是与细胞周期相关的E3酶，能通过识别磷酸化的底物蛋白使其被proteasome降解。Skp2为含F-box结构域蛋白家族的成员，其N端含有40个氨基酸左右的WD保守序列结构，介导与Skpl的相互作用，称为F-box motif; C端的一段底物识别序列，直接介导与磷酸化底物的结合，是SCFSkP2复合物选择性降解底物的结构基础。令人感兴趣的是，SCF复合物能介导周期素依赖激酶抑制因子(CDKI)-p21wAF1/CIP1和p27KIP1等蛋白的降解。p21参与细胞G1／S或G2／M检查点调控，p27参与细胞G1／S检查点的调控。GI／S cell cycle checkpoint调控细胞DNA的合成，起始细胞增殖；而G2／M cell cycle checkpoint是维护基因组稳定性、监视细胞恶性增殖的最后关卡。它们在肿瘤的发生、发展中有至关重要的意义。新的研究进展发现：Skp2在多种肿瘤组织和肿瘤细胞中异常高表达，有癌基因的特性。小细胞肺癌细胞(SCLC)中skp2基因在染色体水平上高度扩增，从而导致细胞中Skp2蛋白高表达，促进细胞恶性增殖；相反，反义寡核苷酸抑制Skp2的表达，则诱导SCLC细胞的周期阻滞和凋亡发生，所以，细胞内的Skp2表达水平直接反映了细胞的增殖状态。Skp2虽与细胞周期密切相关，但它调控细胞增殖的具体机制以及作为癌基因的作用机理仍不清楚。以往研究表明，Skp2通过调控p27的降解促进细胞G1→S期相转换，但Latres认为，p27并不是Skp2的唯一的下游靶分子。我们知道，p21既是SCFSkp2复合物的底物，又是细胞周期G1／S和G2/M检查点调控的关键分子。博士论文中文摘要研究发现:在所有的人类肿瘤组织和细胞中低表达或表达。那么，SkpZ是否参与细胞周期检查点的调控?肿瘤细胞中高表达的SkpZ如何调控低表达的pZI?这种负调控的分子基础及机制又是什么?据此，本论文进行以下四个方面的研究:(1)通过RNAI或反义寡核普酸抑制S冲2的表达，或过表达SkpZ及其F一box缺失突变体，探讨SkPZ在细胞周期检查点调控中的功能意义;(2)通过抑制或过表达SkPZ，探索SkpZ是否通过调节pZI的稳定性参与周期检查点的调控;通过免疫共定位、免疫共沉淀以及GST-pull down实验，揭示高表达SkPZ负调控pZI的分子基础;(3)通过体外磷酸化和免疫沉淀，验证PKA磷酸化修饰pZI及对其泛素化修饰的影响;(4)应用蛋白质组学手段，探索蛋白酶体抑制剂一MG132诱导HL60细胞发生GZ/M期阻滞和凋亡的分子机制。 本课题获得研究进展如下: 1.SkpZ参与HeLa细胞周期检查点的调控。HeLa细胞中过表达全长SkPZ时，S冲2促进细胞周期运转，表现为S期细胞增多;过表达SkPZ的F一box缺失突变体时，细胞周期没有变化，表明SkpZ与细胞增殖活性密切相关，F一box结构域对其行使功能具有重要意义;同时，通过RNAi抑制skPZ表达后，细胞中s期细胞比例减少，而GO/GI和GZ/M期细胞的比例增加:转染SkPZ的反义寡核昔酸明显抑制HeLa和A549细胞的增殖活性，并诱导HeLa细胞发生显著的 GZ胭期阻滞。这些结果表明:SkPZ在HeLa细胞Gl/S和GZ叔检查点调控中扮演了重要角色。 2.HcLa细胞中高表达的skPZ通过负调控pZI而非p27的稳定性来实现对周期检查点的调控。在外周血淋巴细胞增殖和放线菌素D抑制肿瘤细胞增殖模型中，验证了SkPZ负调控P21稳定性的结论;而免疫荧光结果表明，SkPZ和P21共定位于细胞核，继而相互免疫共沉淀和Gs手pull down实验结果证明，P21与skPZ之间存在直接的相互作用，结合区不在SkpZ的F一box结构域。这些结果表明，skPZ负调控P21的分子基础是通过SkPZ识别P21。 3.SkpZ对p21的负调控受PKA对pZI的磷酸化修饰的影响，也即SkPZ识别的是被PKA磷酸化的pZI分子。PKA在体外能磷酸化修饰pZI，磷酸化位点是Thr’4，;PKA激酶的特异性抑制剂能提高P21的稳定性，表现为P21泛素化水平的降低;免疫共沉淀结果表明，pZI被PKA磷酸化修饰后结合 SkPZ的能力增强，p21泛素化水平升高，从而导致pZI稳定性的降低。上述结果表明，SkPZ对pZI的识博士论文中文摘要别受PKA对p21磷酸化修饰的影响，同时揭示了p21的磷酸化修饰和泛素化修饰之间的关系。 4.引入蛋白质组学技术手段，初步探索蛋白酶体抑制剂一MG132诱导HL60细胞GZ从期阻滞和凋亡生成的分子基础。应用MG 132处理8h后的HL60细胞发生明显GZ舰阻滞，收细胞、提取核蛋白，通过二维电泳和质谱分析，获得几个可能参与细胞GZ舰周期检查点调控的差异核蛋白，