【摘 要】
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藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）,一种天然生物可直接食用且具荧光的蛋白。因其独特的物理生物特性而被广泛应用于食品、保健、医疗、生物靶向治疗等多个方面。国际上多将藻蓝蛋白的纯度划分为食品级、分析级、试剂级三个等级,其纯度决定了价格,纯度越高则应用价格越高,寻找更为高效、简捷、绿色的藻蓝蛋白分离纯化方法是具有重要的理论和现实意义的。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvent
【基金项目】
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山东省重点研发项目（2018GHY115021）
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藻蓝蛋白（C-phycocyanin,C-PC）,一种天然生物可直接食用且具荧光的蛋白。因其独特的物理生物特性而被广泛应用于食品、保健、医疗、生物靶向治疗等多个方面。国际上多将藻蓝蛋白的纯度划分为食品级、分析级、试剂级三个等级,其纯度决定了价格,纯度越高则应用价格越高,寻找更为高效、简捷、绿色的藻蓝蛋白分离纯化方法是具有重要的理论和现实意义的。低共熔溶剂（Deep Eutectic Solvents,DES）,是一种继离子液体（Ionic Liquids,IL）之后的新型绿色溶剂。其与离子液体具有相似的理化性质,但组成原料更为绿色,制作成本更低且制备过程简单。低共熔溶剂双水相体系（Deep Eutectic Solvents-Aqueous Two-Phase System,DES-ATPS）是融合低共熔溶剂和双水相体系优点的新型绿色萃取纯化体系,这一体系具有生物兼容性良好、不易乳化、无污染、制备成本低、操作过程简单等优点,已成功应用于生物大分子（如核酸、牛血清白蛋白等）分离纯化过程。本论文共构建五种低共熔溶剂双水相体系,将其成功运用于藻蓝蛋白的分离纯化,并利用响应面优化DES-ATPS纯化C-PC的条件,最后对本论文纯化所得C-PC进行稳定性及抗氧化性研究。研究内容包括以下几个方面:本论文首先以氯化胆碱作为氢键受体,与五种氢键供体:尿素、D-（+）-葡萄糖、D-（-）-果糖、乙二醇和甘油合成五种DES,并与K2HPO4盐溶液构建低共熔溶剂双水相体系。采用浊点滴定法绘制双水相相图,得到五种DES成相难易程度为:ChCl-U>D-ChCl-Fru>D-ChCl-Glu>ChCl-EG（?）ChCl-G;测定氢键供体及其对应DES的p H值,发现HBD的种类及其摩尔占比对其相应DES酸碱性的影响显著。测定萃取过程中的热力学参数,结果显示C-PC富集在富DES相是自发行为,且是一个吸热过程。本文以钝顶螺旋藻为研究对象,通过反复冻融法提取藻蓝蛋白粗提液,将DES-ATPS运用于C-PC后续的分离纯化,并运用响应面对纯化过程进行优化,建立优化模型。结果表明:当DES种类为[氯化胆碱-尿素],DES质量为3.26 g,K2HPO4盐浓度为1.0 g m L-1,Na Cl添加量为1.0%,萃取温度为25℃,萃取时间为3.0 h时,藻蓝蛋白的纯度达到最优,蛋白的纯度为3.376(A620/A280)。进一步利用SDS-PAGE对纯化结果进行了验证,表明该模型对于C-PC优化分离的应用是可行的;通过紫外光谱和荧光光谱对纯化C-PC进行表征,可证明DES-ATPS能够提供温和的萃取环境。最后,本文以第三章所得纯化C-PC为研究对象,探究温度、pH值、食品添加剂、蛋白质抑制剂以及DES含水量对其稳定性的影响,并通过ABTS和DPPH自由基清除率对C-PC抗氧化活性进行研究。结果表明:应在不高于35℃且p H环境为7.0的条件下对C-PC处理和应用;添加一定的糖类和盐能够提高C-PC稳定性。同时发现[氯化胆碱-尿素]低共熔溶剂不宜作为长时间储存C-PC的溶剂。本文所得纯度为1.211的粗提液以及纯度为3.365的纯化样品对ABTS自由基清除率的IC50为0.116 mg m L-1和0.093 mg m L-1,对DPPH清除率的IC50为0.347 mg m L-1和0.241 mg m L-1,呈现出较好的抗氧化能力。
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