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研究背景腰椎间盘突出症是脊柱外科最常见的病症之一,导致腰椎间盘突出症的病理基础主要是腰椎间盘退变(intervertebral disc degeneration; IVDD),其表现为凝胶样髓核消失,髓核与纤维环原有清晰界限逐渐消失,纤维环板层粗糙和进行性纤维化。据统计：全世界约80%-90%的人曾经受到过腰腿痛的折磨,其中腰椎间盘退变、突出是最常见的病因,其确切的发病机制尚未完全明确,临床治疗难于达到理想境界。综合既往研究表明,IVDD是多因素协同作用导致的,包括遗传因素、生物力学、生物化学因素等。以基质金属蛋白酶-2(MMP-2)等为代表的基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase;MMPS)引起基质成分合成、降解紊乱而造成细胞外基质成分的变化是椎间盘力学特征丧失的直接原因之一,进而引起一系列的临床症状。近年来的研究表明缺氧诱导因子-1α(Hypoxia-inducible factor-1α; HIF-1α)在人类突出腰椎间盘中有表达,从而得出结论：HIF-1α在人椎间盘细胞的生成和突出间盘重吸收方面可能起重要作用。在人类的退变椎间盘中HIF-1α与MMP-2的表达有无相关性及它们是如何参与椎间盘的退变过程等方面尚未发现文献报道。有鉴于此,本实验通过对人类正常椎间盘和退变椎间盘组织的对比,应用免疫组织化学染色的方法,观察和分析人类退变椎间盘中的HIF-1α和MMP-2的表达情况。研究目的探讨缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)在人类退变腰椎间盘髓核组织中的表达变化情况；评价HIF-1α、MMP-2在人类腰椎间盘退变过程中的作用,并分析两者之间的关联性。研究方法取材均来自南方医科大学第三附属医院脊柱外科2008年1月～2009年6月收集的57例手术标本,分为实验组和对照组：实验组45例,对照组12例。实验组为45例确诊腰椎间盘突出症需手术切除的患者,术中切除的仍位于纤维环内的椎间盘髓核组织,其中男33例,女12例；年龄为20～40岁,平均年龄为31.5岁,病程为3个月～10年。突出部位：L4／L5椎间盘突出23例,L5／S1椎间盘突出20例,L4／L5、L5／S1椎间盘突出2例。根据术前MRI影像表现,对实验组退变腰椎间盘髓核组织分为A、B、C三组,A组：椎间盘信号强度轻度减低,B组：椎间盘信号强度中度减低；C组：椎间盘信号明显减低；对照组12例为正常椎间盘髓核组织,来源于青年脊柱骨折患者行前路减压内固定术时切除的椎间盘髓核组织,术前MRI的T2像见椎间盘呈均匀高信号,其中男10例,女2例；年龄为21-45岁,平均33.7岁。标本取出后均用4%的多聚甲醛固定,而后立即将收集的每个椎间盘髓核组织行石蜡包埋切片,制备5μm的厚组织切片,保存于0～4℃冰箱,HE染色和待免疫组织化学检查。HIF-1α及MMP-2均购自武汉博士德生物有限公司。具体步骤如下：①石蜡切片常规脱蜡。②3%双氧水室温孵育5-10 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。③双氧水冲洗3次,热抗原修复后,PBS(PH7.2-7.6)冲洗3min×2次,滴加5%BSA封闭液,室温20min。甩去多余液体,不洗。④滴加适当稀释一抗(抗人HIF-1α单克隆抗体1：100,或抗人MMP-2单克隆抗体1：100),4℃冰箱过夜。PBS洗2min×3次。⑤滴加生物素化二抗工作液,20～37℃,20分钟。PBS洗2min×3次。⑥滴加试剂SABC,20-37℃,20min。PBS洗5min×3次。⑦显色剂显色(DAB试剂盒)。自来水充分冲洗,复染,封片。显微镜观察。HIF-1α及MMP-2免疫组化染色都定位于细胞浆,故它们的阳性结果均表现为软骨细胞浆内有棕黄色或棕褐色颗粒。每张切片由两名病理医生在10×20光镜下随机选择10个视野“盲法”阅片,确定细胞总数及阳性表达的细胞数。随机选取10个视野内阳性软骨细胞总数÷软骨细胞总数×100%以计算阳性细胞百分数。采用SPSS 13.0统计软件包对计数资料进行显著性检验和相关性分析。结果免疫组化结果为HIF-1α及MMP-2均定位于细胞浆,故显微镜下见HIF-1α及MMP-2的免疫组化阳性结果均表现为软骨细胞胞浆内有棕黄色或棕褐色颗粒,细胞核为淡蓝色。HIF-1α在对照组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组椎间盘髓核组织中的表达分别为8.92±3.41%、46.81±3.63%、66.88±4.60%、89.63±2.27%；MMP-2在对照组、轻度退变组、中度退变组、重度退变组椎间盘髓核组织中的表达分别为9.61±3.03%、47.31±4.41%、69.54±5.96%、90.05±3.16%。HIF-1α、MMP-2在实验组退变的椎间盘中的表达显著高于对照组(P<0.05),而且不同退变程度的表达也不同(P<0.05),统计学分析均有显著差异。组间相关系数(r)为0.959,表明HIF-1α和MMP-2在退变的椎间盘组织中的表达呈正相关的关系。结论HIF-1α、MMP-2均可能参与了人类腰椎间盘组织的退变过程,且HIF-1α、MMP-2在人类退变腰椎间盘组织中有相同的增高趋势。HIF-1α可能与MMP-2相互协调、共同促进椎间盘退变。这些方面的深入研究及有益尝试将为预防和治疗腰椎间盘髓核退变提供新的思路。