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目的克隆广东地区人乳头瘤状病毒(HPV)18型L1基因,分析其结构特点;构建广东分离株HPV18 L1毕赤酵母分泌型表达载体,并转入酵母菌GS115,诱导其表达及鉴定。方法1.采用PCR技术从广东地区宫颈癌患者癌组织中扩增出HPV18L1基因。克隆入毕赤酵母表达载体pPICZaB,测序并进行序列分析。2.将毕赤酵母表达载体pPICZaB HPV18 L1分别用化学转化法和电转法转入毕赤酵母GS115中,并进行表型筛选和Zeocin抗性筛选,对整合了目的基因的重组酵母表达菌株进行PCR鉴定,并优化电转条件。3.以0.5%(V/V)甲醇诱导目的蛋白表达,通过SDS-PAGE及Western blot鉴定目的蛋白的表达。结果1.扩增出了广东地区HPV18 L1基因,其序列与Genebank收录的标准株相比有4处碱基存在差异,同源性为99.8%,其中3处由于碱基的改变,导致其编码的氨基酸也发生了变化。2.构建了毕赤酵母表达载体pPICZαB-HPV18 L1,通过双酶切鉴定及序列测定确定构建成功。3.将重组质粒pPICZαB-HPV18 L1转入毕赤酵母,通过对电转条件的优化获得最佳电转条件。4.广东分离株HPV18 L1蛋白的酵母表达:a.在30℃条件下,以0.5%(V/V)甲醇诱导工程菌GS115/pPICZαB-HPV18 L1表达。发酵上清经SDS-PAGE电泳检测显示,上清中均有特异蛋白表达;b.诱导条件的优化:在30℃条件下,以0.5%(V/V)甲醇诱导72h,蛋白表达量可达到最大值,目的蛋白HPV18L1的最高表达量约为105mg/mL。结论1.广东地区HPV18 L1基因序列与标准株、中国其它地区分离株相比较均存在差异。2.正确构建了毕赤酵母表达载体pPlCZCαB-HPV18 L1。3.目的蛋白HPV18L1在毕赤酵母菌中成功表达,通过优化诱导条件得到较大量的蛋白表达。