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1. DHBVPreC/C基因序列分析、克隆表达、蛋白纯化及多抗制备为了建立DHBV’快捷准确的检测方法及深入探究鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白的功能,对DHBV CHv株PreC/C基因及其编码蛋白的分子特性进行了分析。PCR方法扩增编码衣壳蛋白的PreC/C基因,经测序鉴定后构建PreC/C基因的原核表达载体pET-32a(+)/PreC/C。利用大肠杆菌宿主表达菌Rosetta (DE3)对衣壳蛋白进行诱导表达,同时对诱导温度、诱导时间、IPTG浓度进行了优化。利用重组衣壳蛋白的组氨酸标签,采用Ni离子亲和层析柱对衣壳蛋白进行纯化。通过纯化的衣壳蛋白免疫大白兔制备兔抗DHBV衣壳蛋白多克隆抗体。结果表明,PreC/C基因长789 bp,编码262个氨基酸的衣壳蛋白。构建有PreC/C基因原核表达载体pET-32a(+)/PreC/C在表达菌Rosetta (DE3)中诱导表达时,DHBV衣壳蛋白在诱导温度37℃、IPTG浓度0.8mmM、诱导时间6h的条件下其表达量达到最高,占菌体总蛋白量的80%以上。利用Ni离子亲和层析柱对带有组氨酸标签的目的蛋白进行纯化后得到条带单一、浓度达2mg/mL的重组衣壳蛋白。通过纯化的衣壳蛋白免疫动物所得到的血清在琼扩试验中效价达到1：32。2.鸭乙型肝炎病毒衣壳蛋白间接ELISA方法的建立为了建立稳定可靠的DHBV血清学诊断方法,本研究利用重组表达的DHBV衣壳蛋白建立间接ELISA诊断方法。利用棋盘滴定法对抗原最佳包被量进行了优化,随后对抗原的包被时间、包被温度进行了优化,同时对间接ELISA方法中的封闭时间、二抗工作浓度等条件进行了优化。利用建立的ELISA方法对27份DHBV阴性血清进行检测,确定了判定样品为阴性或阳性的临界值,并通过该临界值对建立的ELISA方法敏感性、特异性、重复性及可靠性等进行了评估。结果表明,基于重组表达衣壳蛋白间接ELISA方法的最佳反应条件为：抗原37℃包被2h后4℃过夜,6.7μg/孔；1%BSA37℃封闭2h：二抗工作浓度为1：1000；待检血清稀释至1：160。根据确定的临界值0.392,DHBV阳性血清能被检测为阳性的最大稀释倍数为1：12800；重复性试验表明组内、组间试验的变异系数均小于10%；该ELISA方法检测常见鸭源病原抗血清时均无阳性结果；对75份临床样品进行检测时,与传统的检测方法PCR相比达到95.45%的符合率。说明该DHBV衣壳蛋白间接ELISA检测方法具有灵敏度高、重复性好、特异性强的特点。此外,本方法运用羊抗鸭IgG抗体替代了兔抗鸭与羊抗兔抗体的联用,是该方法更为简便快捷、节约成本。3. PreC/C基因转录时相及表达时相的研究DHBV基因组在复制的过程中会先转录形成一条长链RNA (preRNA),然后反转录形成DNA达到病毒基因组复制的目的。该长链RNA除了扮演DHBV基因组复制中间体的角色外,还能作为DHBV DNA多聚酶P蛋白的mRNA翻译为P蛋白,或充当DHBV PreC/C基因的mRNA,翻译为DHBV的衣壳蛋白。本研究通过建立的DHBV感染鸭原代细胞模型,采用实时荧光定量PCR技术及相对定量分析方法,对preRNA在病毒感染细胞后的不同时间点进行定量分析。在相同时间点,运用间接免疫荧光及免疫印迹技术对DHBV衣壳蛋白的表达情况进行检测。结果表明,preRNA在病毒感染后的12h开始出现,20h达到最大峰值；而衣壳蛋白在病毒感染后的12h及20h并未被检测到,直到24h才能被检测到。说明preRNA在DHBV在体外感染细胞的早期并不用于衣壳蛋白的翻译,该结论为DHBV病毒粒子在复制过程中的装配机制提供新的线索。