目的:百草枯(PQ)是一种高效、廉价的除草剂,与土壤接触后可迅速失活,植物体内很少残留,如能正常使用,则安全性高,且环境污染少,有利于可持续农业的发展。然而,因偶然摄入或蓄意自杀所致的PQ中毒事件,在临床上却屡见不鲜,在世界范围内口服农药自杀事件中也非常常见,且致死率很高,严重中毒后存活率不足50%。由于其中毒机制迄今不明,没有特效解毒剂,其中毒后给人们带来的危害不可忽视。PQ中毒可导致多种器官功能障碍,且以肺损伤最为严重,中毒早期以急性肺损伤及急性呼吸窘迫综合征为主要表现,也是中毒早期主要的死亡原因。目前研究认为,氧化损伤及免疫炎症反应在PQ中毒发病过程中的作用不可估量,但具体分子机制不明。PQ中毒可以引起细胞DNA损伤。正常情况下,在真核细胞中,只有细胞核和线粒体中存在DNA,它是遗传信息的载体,对维持机体生命活动至关重要。当组织细胞损伤时导致遗传物质外漏,易位的self-DNA异常增多,可以作为损伤相关分子模式(DAMPs)而存在,是诱发免疫炎症反应的重要原因,也是导致肺部炎症损伤的重要因素。线粒体DNA(mtDNA)是self-DNA的重要成员之一,其在PQ中毒发病机制中的重要性已得到认可。近年来,细胞内DNA感应通路cGAS-STING信号通路,在介导self-DNA所致机体免疫炎症疾病中的重要作用,受到广大学者的关注。熊果酸(UA),是一种五环三萜类化合物,具有抗炎、抗氧化、保护线粒体功能、修复DNA损伤等重要作用,可以减轻LPS引起的小鼠急性肺损伤及脓毒症大鼠肺损伤。我们的实验旨在探索UA对PQ中毒小鼠急性肺损伤的治疗作用,并证实这一作用的发挥,与抑制cGAS-STING信号通路相关。研究方法:一、动物模型的建立C57BL/6J小鼠,SPF级,雄性,体重18-22g。一次性腹腔注射PQ 30mg/kg,构建急性肺损伤模型。二、细胞模型的建立RAW264.7小鼠巨噬细胞,用含10%热灭活胎牛血清的DMEM高糖培养基培养。以不同浓度PQ处理细胞,并结合CCK8实验筛选最佳药物处理浓度。三、STING-IRF3信号通路介导PQ中毒急性肺损伤的研究1、分别在PQ给药后2、12、24和48 h采集标本。通过检测肺组织中MDA和SOD表达水平,评估肺组织氧化损伤。分别用RT-qPCR、western blot、ELISA法检测肺组织或血清中Sting、Irf3、Ifnβ的mRNA或蛋白表达水平。2、在PQ给药后1 h,予小鼠腹腔注射地塞米松5 mg/kg(日一次)治疗。染毒后观察48 h,采集标本。HE染色观察肺组织病理变化,计算肺组织湿重/干重(W/D)比值评估肺水肿程度,免疫组化法观察STING、IRF3在肺组织的表达情况,RT-qPCR、western blot、ELISA法分别检测地塞米松治疗后,肺组织或血清中Sting、Irf3、Ifnβ的mRNA或蛋白表达水平。3、以小干扰RNA靶向沉默RAW264.7细胞中Sting、Irf3的表达。于PQ染毒后24 h,分别用免疫荧光、RT-qPCR、western blot、ELISA法观察RAW264.7细胞中或细胞上清中Sting、Irf3、Ifnβ的mRNA或蛋白表达水平。四、TBK1参与STING-IRF3信号通路介导PQ中毒急性肺损伤的研究1、在PQ染毒前3日开始给予小鼠氨来占诺100 mg/kg日一次灌胃。在PQ染毒后72 h收集标本。用HE染色及肺泡灌洗液蛋白浓度测定评估肺组织病理损伤情况,活性氧(ROS)检测评估肺组织氧化损伤情况,免疫组化法观察肺组织NF-κBp65、IRF3的表达分布情况,western blot检测肺组织细胞浆蛋白中STING、TBK1、pTBK1及细胞核蛋白中NF-κBp65、IRF3的表达水平,RT-qPCR、ELISA法检测肺组织或肺泡灌洗液中Il-1β、Ifnβ的mRNA或蛋白表达水平。2、利用CCK8实验筛选氨来占诺处理RAW264.7细胞的最佳浓度。ROS检测评估RAW264.7细胞氧化损伤情况,免疫组化法观察NF-κBp65、IRF3在RAW264.7细胞的表达分布情况,western blot检测RAW264.7细胞的胞浆蛋白中STING、TBK1、pTBK1及细胞核蛋白中NF-κBp65、IRF3的表达,RT-qPCR、ELISA法检测RAW264.7细胞或细胞上清中Il-1β、Ifnβ的mRNA或蛋白表达水平。五、UA通过抑制cGAS-STING通路缓解PQ中毒小鼠急性肺损伤的研究1、在PQ染毒前1日开始给予小鼠UA 50 mg/kg日一次灌胃。在PQ染毒后72h收集标本。测量小鼠体重变化,HE染色观察肺组织病理变化,计算肺组织W/D比值评估肺水肿程度,DHE染色观察肺组织氧化损伤情况,定量检测肺泡灌洗液及血清中dsDNA的水平并利用real-time PCR鉴别dsDNA的来源,western blot检测肺组织cGAS、STING、TBK1、pTBK1、IRF3、pIRF3的表达,ELISA法检测肺泡灌洗液及血清中IFNβ的表达。2、利用CCK8实验筛选UA处理RAW264.7细胞的最佳药物浓度。DHE染色观察RAW264.7细胞氧化损伤情况,定量检测细胞培养上清中dsDNA的水平并利用real-time PCR鉴别dsDNA的来源,western blot检测cGAS、STING、TBK1、pTBK1、IRF3、pIRF3的表达,ELISA法检测细胞培养上清中IFNβ表达水平。结果:1、PQ诱发小鼠肺组织病理改变及W/D比值增高,肺组织及RAW264.7细胞中STING、IRF3(p IRF3)及IFNβ的表达水平增多,STING发生细胞核周聚集,IRF3出现细胞核内转移。地塞米松降低PQ染毒小鼠肺组织中STING、IRF3(pIRF3)及IFNβ的表达水平。靶向抑制细胞中Sting的表达,可以抑制IRF3的活化,减少IFNβ表达。靶向抑制细胞中Irf3的表达,对STING无明显影响,但可抑制IFNβ表达。2、PQ作用于小鼠肺组织及RAW264.7细胞后,伴随STING-IRF3通路的活化,出现pTBK1/TBK1水平增多。TBK1的抑制剂氨来占诺,可以抑制TBK1、NF-κBp65及IRF3的活化,减少IL-1β及IFNβ表达,减轻PQ中毒小鼠肺组织的病理及氧化损伤,减少肺泡灌洗液中蛋白浓度,但对STING无明显影响。3、PQ作用于小鼠肺组织及RAW264.7细胞后,肺泡灌洗液、血清、细胞培养上清中dsDNA(包括nDNA及mtDNA)的表达量增多。肺组织及RAW264.7细胞中cGAS的表达量增多,其下游STING、pTBK1/TBK1、p IRF3/IRF3表达水平增多,肺泡灌洗液、血清及细胞培养上清中IFNβ表达量增多。UA可以有效缓解上述情况,减轻中毒小鼠肺组织的病理及氧化损伤,延缓小鼠体重减轻。结论:1、STING-IRF3信号通路介导了PQ中毒小鼠急性肺损伤。2、TBK1对PQ中毒急性肺损伤时STING-IRF3信号通路的激活起了重要作用。TBK1抑制剂氨来占诺,可以改善PQ中毒小鼠急性肺损伤。3、dsDNA(包括mtDNA及nDNA)参与了PQ中毒急性肺损伤。cGAS-STING信号通路在PQ中毒急性肺损伤过程中发挥了重要作用。UA可以减少PQ中毒急性肺损伤时dsDNA的表达,抑制cGAS-STING信号通路的活化,改善PQ中毒小鼠急性肺损伤。