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第一部分Tacrine,memantine和bis(7)-tacrine对培养大鼠海马神经元NMDA电流抑制作用比较阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)发病机制与胆碱能神经元功能缺损以及神经元凋亡均有密切关系。在治疗AD,特别是防止AD及其它神经退行性病变方面,兼具抗凋亡作用的乙酰胆碱酯酶抑制剂如bis(7)-tacrine将会比单纯的乙酰胆碱酯酶抑制剂发挥更有效的作用。本实验通过膜片钳技术,利用原代培养的大鼠海马神经元,将bis(7)-tacrine与tacrine和memantine对N-methyl-D-aspartate(NMDA)电流的抑制作用做比较,并进一步研究bis(7)-tacrinec对NMDA受体的作用机制。结果显示,三种药物均选择性地作用于NMDA受体,浓度依赖性地抑制NMDA电流,其IC50值分别为3.61±0.78μM,112.33±19.83μM和8.82±1.03μM。Tacrine和memantine均为“开放通道阻滞剂”,作用于NMDA受体通道的内部,表现为“激动剂依赖性”和“电压依赖性”;前者与NMDA受体结合与解离的速度更快,25μM以上浓度tacrine与NMDA同时作用时,停药后产生一内向延迟电流峰。而bis(7)-tacrine对NMDA电流的抑制作用不同于tacrine和memantine,提前1 s给药能明显提高bis(7)-tacrine的抑制作用,但提前更长时间(2-90 s)并无进一步抑制。在钳制电压-50至+50mV的范围内,bis(7)-tacrine对NMDA电流的抑制率没有变化,I-V曲线的翻转电位也没有改变。Bis(7)-tacrine没有明显改变NMDA的EC50值[49.48±2.93μM in the absence of bis(7)-tacrine vs 57.32±8.43μM in the presence of bis(7)-tacrine;ANOVA,P﹥0.05;n = 7-8],但使NMDA最大反应浓度(Emax)降低了约40%(ANOVA,P﹤0.05;n = 7-8),显示bis(7)-tacrine的作用为非竞争性地抑制NMDA激活电流。结果提示,作为一种新型二聚体胆碱酯酶抑制剂,bis(7)-tacrine对NMDA激活电流的的抑制作用强于tacrine和memantine,其作用机制也与它们不同,是以慢作用方式、非竞争性地抑制NMDA激活电流,其临床使用的效能和安全性可能较高。第二部分Bis(7)-tacrine对培养大鼠海马神经元NMDA受体可能的作用位点研究最近的研究证实,bis(7)-tacrine除作为一种乙酰胆碱酯酶抑制剂外,还可通过抑制原代培养大鼠小脑颗粒细胞NMDA受体而防止谷氨酸导致的神经元凋亡。本实验通过全细胞膜片钳记录研究bis(7)-tacrine对原代培养大鼠海马神经元NMDA受体可能的作用位点。结果发现,细胞外液中甘氨酸的浓度从0.1μM增加至10μM,细胞外液pH值从8.1改变到6.7,在细胞外液中加入二硫苏糖醇(2 mM)、精胺(10μM)、镁离子(10至100μM)或锌离子(5至20μM)均不引起bis(7)-tacrine对NMDA电流抑制率的改变。电极内液中加入25μM bis(7)-tacrine也未观察到外加的2.5μM bis(7)-tacrine对30μM NMDA激活电流抑制率的改变(37±3% vs对照组36±4%,P﹥0.05;n = 4)。但是,2.5μM bis(7)-tacrine及5μM dizocilpine(MK-801)分别对30μM NMDA激活电流抑制了36%和22%,而在两种药物都存在的条件下,30μM NMDA电流仅被抑制了37%。结果提示, bis(7)-tacrine虽然不大可能作用于MK-801位点,但MK-801却可以负性调制bis(7)-tacrine对NMDA受体的抑制作用。第三部分Bis(7)-tacrine对表达NR1/NR2A或NR1/NR2B受体的HEK-293细胞NMDA电流抑制作用在正常大鼠前脑,NMDA受体复合物的构成形式主要是NR1/NR2A和NR1/NR2B的二合体形式,少部分以NR1/NR2A/NR2B的三合体形式存在。因此,我们进一步通过表达NR1/NR2A或NR1/NR2B受体到培养的HEK-293细胞,利用膜片钳技术来研究bis(7)-tacrine对NMDA电流的抑制作用。结果显示,在同时给药的情况下,作用于表达了NR1/NR2A受体的HEK-293细胞时,1μM bis(7)-tacrine对30μM NMDA和1000μM NMDA激活稳态电流的抑制分别为46%和40%(ANOVA,P﹥0.05;n = 5),显示其作用方式可能与NMDA浓度无关,可能为非竞争性抑制;而作用于表达了NR1/NR2B受体的HEK-293细胞时,1μM bis(7)-tacrine对NMDA电流的抑制与NMDA浓度有关,对30μM NMDA和1000μM NMDA激活稳态电流的抑制分别为61%和13%(ANOVA,P﹤0.05;n = 6),这似乎是一种竞争性的作用方式。但在1000μM NMDA作用条件下,同时给予1μM bis(7)-tacrine对NMDA激活电流峰值产生了一定的抑制作用,电流逐渐下降到稳态,而在同一细胞上提前5秒给予1μM bis(7)-tacrine却可以将峰值几乎完全抑制。这一结果表明,bis(7)-tacrine对表达NR1/NR2B受体NMDA电流的抑制作用可能为慢作用方式,并不依赖于激动剂的存在。钳制电压从-50到+50mV变动范围内,bis(7)-tacrine对NMDA电流的抑制率没有发生变化,而且其翻转电位没有改变。这些结果与我们前面用培养的海马神经元实验结果趋于一致,证明bis(7)-tacrine作用于表达的NR1/NR2B受体时,还是以非竞争性方式,无激动剂依赖性和电压依赖性,并且对离子的通透没有发生选择性变化。结果提示:在作用于表达了NR1/NR2A或NR1/NR2B的HEK-293细胞时,bis(7)-tacrine仍然以非竞争性方式抑制NMDA电流,可以此为模型进一步开展有关其分子机制的实验研究。