苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)是一种革兰氏阳性细菌,对多种农林害虫具有杀虫活性,被广泛应用用作生物杀虫剂。针对重要地下害虫蛴螬,本实验室分离到多株对蛴螬有效的菌株,Bt菌株对于昆虫作用过程主要包括,晶体蛋白破坏中肠上皮细胞,使中肠上皮发生破坏,产生孔洞,Bt及Bt芽胞通过这些孔洞,进入昆虫的血腔,增殖感染,最终导致蛴螬的败血死亡。近期研究结果显示,Cry8Ga等杀虫蛋白可以高效破坏蛴螬中肠,但是Bt的进一步感染效率较低。针对上述现象,本论文一方面测定蛴螬中肠转录组,分析蛴螬免疫相关基因,探索蛴螬抵御Bt侵染的机制;另一方面,针对蛴螬肠道、血淋巴中的免疫效应物,筛选耐受菌株,为进一步开发蛴螬高效的Bt杀虫剂提供思路,相关研究结果如下:一、完成了大黑鳃金龟三龄幼虫中肠转录组分析。分析结果显示,蛴螬中肠中表达了多类与免疫相关的基因。1,中肠中表达了peptidoglycan recognition proteins等受体蛋白,该类受体是昆虫识别细菌的重要蛋白,将激活蛴螬的免疫途径,表达分泌免疫效应物;2,中肠中表达了高丰度的丝氨酸蛋白酶,该种蛋白酶主要分泌在消化道中,可能会对中肠中Bt细胞产生影响;3,转录组数据还显示蛴螬表达了defincin等免疫效应物,这些免疫效应物通常存在于昆虫血淋巴中,可能会对侵入血淋巴的Bt产生抑制、杀灭作用。二、完成了中肠中与免疫识别相关受体的克隆。1,完成识别革兰氏阳性细菌的受体peptidoglycan recognition proteins(gprp)基因克隆,获得了1个全长基因序列,BLSAT分析结果显示,与东北大黑鳃金龟(Holotrichia diomphalia)的gprp-2基因相似性最高,为61%;2,完成了lectin基因克隆,获得了3个全长基因序列,BLSAT分析结果显示,分别与内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)的Endoplasmic reticulum lectin 1基因相似性最高,相似性为53%;与内华达古白蚁(Zootermopsis nevadensis)的Malectin-B基因和Galectin-4基因相似性最高,相似性分别为62%和46%;于此同时完成了defencin免疫效应物的基因克隆,获得了2个全长基因序列,BLSAT分析结果显示,分别与古铜异丽金龟(Anomala cuprea)的defensin B相似性最高,相似性分别为69%和62%。并且完成了中肠中表达量高的消化酶serineprotease基因的克隆,获得6个全长基因序列,BLSAT分析结果显示,分别与致倦库蚊(Culex quinquefasciatus)的trypsin-5基因相似度最高为30%,赤拟谷盗(Tribolium castaneum)serine protease-P76基因相似度最高为46%;新西兰草地蛴螬(Costelytra zealandica)的serine protease-3基因相似度最高为82%,新西兰草地蛴螬(Costelytra zealandica)的serine protease-4基因相似度最高相似度为68%,大黑鳃金龟(Holotrichia oblita)serine protease 1的基因相似度最高为48%,中华地鳖虫(Eupolyphaga sinensis)的serine protease的基因相似度最高为49%;,该部分工作为进一步设计RNA干扰杀虫剂提供了新靶点。三、完成了161株Bt菌株对蛴螬中肠液耐受程度的测试。供试昆虫是三龄的大黑鳃金龟幼虫。检测中,共有74株Bt菌株对大黑鳃金龟幼虫中肠液显著耐受。上述结果显示,Bt对蛴螬中肠液中的免疫效应物的耐受性是多样的,可以进一步筛选高度耐受肠道液的Bt菌株,用于抗蛴螬Bt杀虫剂的开发。四、完成了对161株Bt菌株对蛴螬血淋巴耐受程度的测试。供试昆虫包括三龄的大黑鳃金龟幼虫和三龄的白星花金龟幼虫;在对大黑鳃金龟幼虫血淋巴的检测中,共有87株Bt菌株对大黑鳃金龟幼虫血淋巴显著耐受;在对白星花金龟幼虫血淋巴的检测中,共有55株Bt菌株对白星花金龟幼虫血淋巴显著耐受;上述结果显示,Bt对蛴螬血淋巴中的免疫效应物的耐受性是多样的,可以进一步通过筛选血淋巴高度耐受的Bt菌株,用于抗蛴螬Bt杀虫剂的开发。通过本论文研究结果显示,蛴螬体内具有针对多种微生物免疫识别受体及多种免疫效应物,本研究克隆的受体基因和免疫效应物基因可以为RNAi杀虫剂开发提供新靶点。进一步在Bt对蛴螬体内免疫效应物耐受测试显示,存在对其免疫效应物高度耐受的菌株,相关菌株可以用于进一步抗蛴螬Bt杀虫剂的开发。本研究的结果对蛴螬的生物防治具有重要意义。